RT-PCR 扩增MUC1检测胃癌微转移研究

　　福建医科大学学报1999年第33卷第3期

陈瑞川　林岚　邱达泰　苏金华　吴艳环

　　 目的：以RT-PCR检测胃周淋巴结胃癌转移细胞并评价其临床应用价值。方法：以MUC1 cDNA的特异序列为RT-PCR引物，酶切分析法及系列稀释法对该法的特异性和敏感性进行分析，对临床收集的胃周淋巴结样品作RT-PCR检测及产物DNA点杂交验证。结果：(1)胃及胃癌组织均存在MUC1 mRNA的表达；(2)该扩增体系具有较好的特异性；(3)敏感性可达1 pg RNA,相当于从10⁵个淋巴细胞中检出1个胃癌细胞;(4)对临床样品检测的结果显示较病理检查敏感,PCR产物点杂交进一步证实MUC1作为PCR标志物有较好的可靠性。结论：该法具有较高的可靠性和较好的应用前景。

　　 关键词：胃癌,转移　反转录多聚酶链反应检测　多形上皮细胞粘蛋白

　　目前癌转移的临床检测多靠病理检查,敏感性较差。反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测癌淋巴结微转移的原理是选择肿瘤起源组织有表达而被转移组织不表达的基因转录产物作为RT-PCR扩增标志物,通过RT-PCR扩增检测淋巴结总RNA中是否有该靶基因的转录产物,以判断是否存在转移的癌细胞^［1］。因此，选择合适的RT-PCR扩增标志物是关键之处。MUC1是多形上皮细胞粘蛋白（polymorphic epothelial mucin）的核心蛋白基因^［2］,已有人将其应用于RT-PCR检测乳腺癌细胞淋巴结微转移^［1］,但尚未见用于检测胃癌细胞淋巴结微转移的报道,而且该基因在胃及胃癌组织中的表达状况也不清楚。本文参考文献［1］以MUC1 cDNA的特异序列为RT-PCR引物，初步探讨MUC1 mRNA作为标志物用于RT-PCR检测临床胃周淋巴结样品微转移胃癌细胞的前景。

　　1　材料与方法

　　1.1　试剂及样品

　　1.1.1　试剂　反转录酶、Taq酶、内切酶等均为Promega产品，DIG DNA标记及检测试剂盒为宝灵曼公司产品，有关的生化试剂等购自华美生物工程公司上海分公司，其余均为国产分析纯。

　　1.1.2　细胞及组织样品　人胃腺癌MGC-803及人早幼白血病HL-60细胞株为本单位细胞生物学研究室保存；常规方法培养。胃周淋巴结样品分别取自胃癌患者手术切除标本（40例）和非癌患者胃手术切除标本（11例），胃及胃癌活检样品取自行胃镜检查患者（共25例）。样品均做病理常规检查，其中淋巴结样品镜检证实转移阳性者32例，阴性者19例。外周血取自健康人，常规方法分离白细胞。

　　1.1.3　引物合成　MUC1及β-actin的引物序列^［1］：

　　MF:5'-GGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA-3'

　　MR:5'-CGTCGTGGACATTGATGGTACC-3'

　　AF:5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3'

　　AR:5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3'

　　以cDNA为模板,MF+MR的扩增产物长288 bp；AF+AR的扩增产物长为154 bp;以基因组DNA为模板的扩增产物,前者长536 bp,后者为254 bp。引物均由上海生工公司合成。

　　1.2　总RNA提取　按Chomczynski的一步法^［3］。

　　1.3　反转录　参照文献^［4］以AMV反转录酶及随机引物进行反转录。

　　1.4　PCR扩增　参照报道方法^［2］，产物以2%琼脂糖电泳分析。

　　1.5　PCR产物的酶切鉴定　根据β-actin及MUC1 PCR扩增产物的序列,以DNASIS软件分析内切酶位点,选择HinfⅠ和Hae Ⅲ按常规方法对上述两种扩增产物进行酶切,聚丙烯酰胺凝胶电泳后EB染色观察。

　　1.6　PCR产物的点杂交验证　取RT-PCR扩增产物经碱变性后于12×8孔的点膜器上点于硝酸纤维膜,80℃烤2 h。另取上述经酶切鉴定及低熔点琼脂糖电泳纯化的PCR产物为模板,按DIG DNA标记检测试剂盒说明进行探针标记及杂交检测^［5］。

　　2　结　果

　　2.1　胃及胃癌组织的RT-PCR扩增检测　胃活检标本及胃癌组织以RT-PCR检测MUC1 mRNA,显示均有MUC1基因表达,而HL-60及正常淋巴结仅有β-actin表达。表明MUC1 mRNA可用作胃癌淋巴结微转移检测的标志物。

　　2.2　RT-PCR的扩增特异性　由DNASIS软件系统分析结果，MUC1的RT-PCR产物经Hinf I酶切后可产生248 bp及40 bp的片段,经HaeⅢ酶切后产生202,33,31及22 bp的片段;β-actin的PCR扩增产物经HinfⅠ酶切后产生86 bp及68 bp的片段(图1)。上述MUC1及β-actin的部分PCR产物分别经HinfⅠ或HaeⅢ酶切后电泳分析显示,酶切后产生的片段均正确，表明MUC1 mRNA用作RT-PCR的标志物有较好的扩增特异性。

图1　部分样品RT-PCR扩增产物的酶切分析结果

　　Ma:pGEM-3Zf(+)/HaeⅢ marker； 1:HL-60; 2:淋巴结; 3:外周血白细胞; 4:β-actin; 5,8:MGC-803; 6,9:胃活检标本; 7:MUC1

　　2.3　RT-PCR的检测敏感性　来自MGC-803总RNA的反转录产物按10倍稀释后各取1 μl(相当于100 ng,10 ng,1 ng,100 pg,10 pg,1 pg,100 fg RNA),再各加外周血白细胞RNA反转录产物1 μl(相当于RNA 0.1 μg)混合作为模板,分别以MUC1及β-actin的引物进行PCR扩增,扩增后将MUC1及β-actin的扩增管中PCR产物混匀,电泳分析结果见图2。检测敏感性达1 pg RNA,该敏感性相当于从10⁵个淋巴细胞中检测出1个胃癌细胞。

图2　RT-PCR的检测敏感性分析

　　Ma:pGEM-3Zf(+)/HaeⅢ marker； A:β-actin; M:MUC1; 1～7:100 ng,10 ng,1 ng,100 pg,10 pg,1 pg,100 fg MGC-803 RNA

　　2.4　临床样品的RT-PCR分析　以MUC1引物及β-actin引物分别对所收集的胃周淋巴结样品进行RT-PCR检测。40例来自胃癌患者的标本中RT-PCR检测和病理切片检查均转移阳性者为32例，另8例病理检查阴性者中有5例被RT-PCR检测阳性（图3）；来自非胃癌患者(无癌细胞)的11例胃周淋巴结标本，RT-PCR检测和病理检查结果均阴性,表明RT-PCR检测敏感性较病理检查法高（附表）。

图3　病理检查阴性胃周淋巴结样品的RT-PCR检测结果

　　Ma:pGEM-3Zf(+)/HaeⅢ marker;1,2:病理检查阳性胃癌淋巴结样品; 3～10:病理检查阴性胃癌淋巴结样品（其中8～10 MUC1阴性）; 11,12:非胃癌胃周淋巴结样品.

附表　胃周淋巴结样品RT-PCR检测与病理检查结果比较

　　2.5　PCR产物的点杂交验证　以上述RT-PCR产物点膜,分别以β-actin及MUC1的DIG标记探针进行杂交检测,以β-actin探针杂交检测所有产物均阳性；MUC1探针检测显示上述RT-PCR检测阳性者（37例）均有杂交信号，阴性者（14例）则无，表明MUC1作为RT-PCR检测胃癌淋巴结微转移标志基因有较好的可靠性。部分胃周淋巴结样品RT-PCR产物的点杂交检测结果见图4。

图4　病理检查阴性胃周淋巴结样品RT-PCR产物的DNA点杂交结果

　　M:MUC1探针杂交; A:β-actin探针杂交; a1～4,c1～4:病理检查阳性胃癌淋巴结样品; a5～12,c5～12:病理检查阴性胃癌淋巴结样品; b1～11,d1～11:非胃癌淋巴结样品; b12,d12:生理盐水对照.

　　3　讨　论

　　MUC1是多型上皮细胞粘蛋白的核心蛋白基因,已被证实在淋巴细胞中不表达^［2］,而在乳腺癌^［1］、胆管癌^［2］等上皮源肿瘤细胞中有表达。Noguchi的报道证实MUC1可用于检测乳腺癌淋巴结微转移^［3］，敏感性达1个乳腺癌细胞/10⁶个淋巴细胞，但未见有其他应用报道。胃癌为上皮源细胞,笔者推测胃癌细胞也应有MUC1基因表达。本文以RT-PCR方法对胃活检标本及胃癌组织进行了检测,发现MUC1基因在胃及胃癌组织的表达率为100%，表明MUC1 mRNA可作为检测胃癌淋巴结转移的标志物。对检测敏感性的分析显示本法可从10⁵个淋巴细胞中检测出1个胃癌细胞,比Mori报道^［6］的以CEA mRNA为标志物检测胃癌淋巴结转移的敏感性高10倍，也较病理探查结果更敏感；但比Noguchi报道^［2］的敏感性低。这一方面可能与各作者的标定方法不同有关，另一方面是否与MUC1在胃癌及乳腺癌细胞表达量不同有关尚待探讨。

　　RT-PCR检测的敏感性已被公认，但也常出现非特异扩增^［7］；由于目前尚无较RT-PCR更敏感的方法来对RT-PCR的临床检测结果的特异性进行验证，本文尝试以酶切分析法及DNA点杂交法对扩增产物进行分析，其根据在于若能证实扩增产物的特异性即可确定RT-PCR检测结果的可靠性^［7］；同时对临床样品也作了选择，特选了取自非胃癌患者手术标本(不存在胃癌转移)淋巴结来进行RT-PCR检测，较全面地考察了本法的特异性，显示MUC1作为RT-PCR法检测胃癌淋巴结转移的标志基因具有较高的可靠性及应用价值。此外，本法对于乳腺癌^［4］等上皮源肿瘤淋巴结微转移以及外周血中转移胃癌细胞的检测可能尚有一定的应用价值。

　　福建省卫生厅科研基金资助课题（96075）

　　作者单位：陈瑞川　林　岚　苏金华　厦门大学抗癌中心(厦门　361005)

　　邱达泰　厦门市思明区人民医院内科(厦门　361005)

　　吴艳环厦门市中山医院消化科（厦门　361005)

　　参考文献

　　1　Noguchi S,Aihara T,Nakamori S,et al. The detection of breast carcinoma micrometastases in axillary lymph nodes by means of reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Cancer, 1994;74:1595

　　2　Zotter S,Hageman C,Lossnitzer A,et al. Tissue and tumor distribution of human polymorphic epithelial mucin. Cancer Rev, 1988;11:55

　　3　Chomczynski P,Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidnium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987;162:156

　　4　荆永娜,卢大儒,邱信芳,等. 影响反转录过程多种因素的探讨. 细胞生物学杂志, 1998;20:38

　　5　陈瑞川,杨善民,张　铮,等. 视黄酸对BEL-7402细胞酶活性及基因表达的影响. 厦门大学学报, 1998,37:259

　　6　Mori M, Mimori K, Inouc H, et al. Detection of cancer micrometastases in lymph nodes by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Cancer Res, 1995;55:3417

　　7　林万明（主编）. PCR技术操作和应用指南. 北京:人民军医出版社,　1993：39～50