重组RA538腺病毒对人胃癌细胞的体内及体外分子治疗研究
第三军医大学学报1999年第21卷第5期
陈洁平 徐采朴 林晨 张雪艳 付明 邓友平 程金科 吴旻
提 要 目的：研究重组RA538腺病毒对胃癌细胞的体内外生物学作用。方法：采用LacZ基因X-gal染色、MTT、克隆形成试验、DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪、裸鼠致瘤性、裸鼠皮下移植瘤模型实验等方法，对RA538重组腺病毒在人胃癌SGC7901细胞系中的作用进行体内外研究。结果：Ad-RA538对SGC7901细胞产生明显的生长抑制作用，MTT显示生长抑制率为76.3%。DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪显示Ad-RA538诱导了SGC7901细胞凋亡。经Ad-RA538处理的SGC7901细胞裸鼠致瘤性消失。Ad-ASc-myc对裸鼠皮下移植瘤模型瘤内注射能有效降低肿瘤的生长速度，生长抑制率为60.66%。结论：Ad-RA538对胃癌细胞具有显著的体内外生长抑制及凋亡诱导作用。
关键词：腺病毒 基因治疗 胃癌 维甲酸
胃癌为常见恶性肿瘤，发病率及死亡率均居我国各种恶性肿瘤的前列。探索胃癌发生发展过程中基因变异规律，寻找有效的针对肿瘤细胞的目的基因，无疑对临床胃癌的防治具有重要意义［1,2］。抑癌基因RA538为维甲酸(Retinoic acid,RA)诱导基因［3］。该基因能诱导肿瘤细胞终末分化、凋亡及下调c-myc基因表达［4］。腺病毒载体的发展使基因治疗付诸于临床应用成为可能，它以遗传毒性低、致病性小、宿主范围广、滴度高、装载容量大等优势已广泛用于基因治疗［5］ 。本课题研究腺病毒(Adenovirus,Ad)介导RA538对人胃癌细胞生物学行为的影响，探索腺病毒介导RA538治疗胃癌的可行性，为胃癌的基因治疗提供候选基因。
1 材料与方法
1.1 细胞系
293细胞：为腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系。培养条件为高糖DMEM培养基，含10%胎牛血清，37℃，5%CO2。SGC7901细胞：为人胃腺癌细胞系。培养条件为M199培养基，含10%胎牛血清，37℃，5%CO2。
1.2 重组体腺病毒的制备［6］
为E1和E3区缺失的复制缺陷型5型腺病毒载体。重组RA538及LacZ腺病毒（Ad-RA538及Ad-LacZ）均为中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室构建。采用Ad-RA538及Ad-LacZ经鉴定为阳性的重组体腺病毒，在293细胞进行繁殖及滴度测定。提取腺病毒DNA，用一对RA538基因引物及一对腺病毒基因组引物进行PCR扩增鉴定。
1.3 腺病毒转导效率测定
用重组腺病毒Ad-LacZ(含报告基因LacZ)，按25、50、100、200感染强度(Multiplicity of infection,MOI)感染细胞。X-gal染色后显微镜下观察蓝染的细胞即LacZ基因表达的阳性细胞。分别计算蓝染细胞的百分率。
1.4 细胞生长曲线——MTT法
采用96孔板，每孔接种细胞5000～8000个，37℃，CO2孵箱中培养12～24h后用病毒感染细胞。取不同时间点，弃去培养基，每孔加入MTT溶液。37℃孵育3～4h，弃去MTT溶液。每孔加入DMSD,将96孔板置水平摇床上摇动后以酶标仪在525nm波长下测定每孔Dλ值。
1.5 平板克隆形成实验
每组取1个35mm培养皿，接种细胞50万个/皿。按不同滴度感染病毒，培养24h后收获细。500个/皿接种至新的60mm平皿中，每种接种3个平皿。置CO2孵箱中培养2～3周。结晶紫染色，显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。
1.6 细胞DNA梯度降解(DNA ladder)的检测
分别收集病毒感染组及对照组细胞。 加裂解液400μl混匀。离心收集上清。加入SDS至终浓度1%，加RNA酶56℃作用2h。加入蛋白酶K37℃2h。乙醇沉淀DNA。干燥后加TE 20μl溶解DNA沉淀。琼脂糖凝胶电泳，长波紫外灯下观察并照相。
1.7 细胞凋亡原位检测（TUNEL试验）
将细胞悬液滴于用多聚赖氨酸处理过的玻片上，涂匀，干燥后用多聚甲醇固定30min，取出自然干燥后按以下步骤进行：PBS洗3次，每次5min。穿透液冰上2min。PBS洗3次，每次5min。加10μlTunel反应混合液，置湿盒中，37℃，1h。PBS洗3次，每次5min。荧光显微镜下观察并照。PBS洗3次，每次5min。AP覆盖液10μl，37℃1h。PBS洗3次，每次5min。底物缓冲液50μl，室温下10～15min，苏木素复染，树脂封片。
1.8 流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡
PI染色法：病毒感染细胞后分别于不同的时间点收集细胞，PBS清洗一遍。注入70%乙醇，固18h。离心弃乙醇后用PBS洗1次。加入RNA酶37℃作用1～2h。加入PI（100μg/ml）100μl混匀置冰上30min后在流式细胞仪上检测。
1.9 PCR分析
PCR条件：25μl反应体系中含DNA 2μl,10×PCR buffer，15mmol/L MgCl2,4种dNTPs各25μmol/L,加目的基因引物50pmol/L及1单位Taq DNA多聚酶，反应在PCR仪中进行。95℃预变性5min，95℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，28～30个循环后72℃延伸7min。PCR产物鉴定及定量分析：PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在长波紫外灯下观察并照相。
1.10 裸鼠皮下致瘤实验
裸小鼠，品系为Balb/C, 5～6周龄，雌雄不限，由中国医学科学院肿瘤研究所动物室提供。接种SGC7901细胞于60mm培养皿中，106细胞/皿，按100的感染强度分别感染Ad-RA538，Ad-LacZ及PBS，24h内消化细胞，制成106细胞/0.1ml的细胞悬液。5周龄雄性裸鼠12只，随机分为4组，每组3只，分别注射Ad-RA538, Ad-LacZ及PBS各0.1ml。连续观察肿瘤出现时间和体积，时间为1个月。
1.11 裸鼠皮下移植瘤模型治疗实验
收集对数生长期SGC 7901细胞，制成细胞悬液，按100μl/只量接种于裸鼠皮下。裸鼠均为5周龄鼠，共23只。雌雄各半。待肿瘤长至5mm左右时，取其中20只肿瘤体积较为均一的裸鼠，随机分为4组，每组5只。瘤体内注射腺病毒液或PBS 0.1ml,病毒液含量为109pfu/只,隔日注射1次，共3次，连续观察肿瘤大小，持续1月。
1.12 统计学分析
采用计算机统计程序进行χ2检验及t检验。
2 结果
2.1 重组体腺病毒的制备
Ad-RA538及Ad-LacZ重组体腺病毒，经293细胞繁殖后制备成病毒贮存液，于－70℃冰箱中备用。各重组体腺病毒滴度测定为Ad-RA538 3.0×109 ，Ad-LacZ 3.0×1011。提取各重组体腺病毒DNA，分别以腺病毒及RA538的引物进行PCR鉴定，结果Ad-LacZ可见腺病毒阳性扩增条带， Ad-RA538可见腺病毒及RA538阳性扩增条带。
2.2 重组体腺病毒的转导效率
采用插入LacZ报告基因的重组体腺病毒，进行重组体腺病毒对不同细胞转导效率的检测。以Ad-LacZ按MOI 25、50、100、200的量分别感染SGC 7901细胞，48h后进行X-gal 染色显示转染效率分别为90、100、100、100。
2.3 腺病毒介导Ad-RA538对胃癌细胞的生物学作用
2.3.1 Ad-RA538感染后胃癌细胞的形态学变化 以Ad-RA538 MOI 100的感染强度感染SGC7901细胞，第1～3天细胞聚集，变圆，胞浆内空泡增多，4～5天后逐渐浮起悬浮于培养基中。对照组细胞形态无明显变化。
2.3.2 Ad-RA538对胃癌细胞生长的抑制作用 ①MTT试验：用MTT法对Ad-RA538、Ad-LacZ感染的SGC7901细胞生长情况进行检测，结果,见图1。Ad-RA538对SGC7901细胞生长抑制率可达76.3%（MOI 200，8d）。与Ad-LacZ组比P＜0.01。②克隆形成试验：按不同MOI 25、50、100、200的量以Ad-LacZ感染SGC7901细胞其存活率分别为89.5%，109.0%，95.8%，117.5%，Ad-RA538为88.8%，70.6%，39.9%，16.1%。说明Ad-RA538可以明显抑制SGC7901细胞的克隆形成能力及存活率。
图1 Ad-RA538对SGC7901细胞生长的抑制作用(8d)
fig 1 Anti-proliferative effect of Ad-RA538on SGC7901 cells(8d)
2.3.3 Ad-RA538对SGC7901细胞的诱导凋亡作用 ①DNA梯度降解试验：提取细胞染色体DNA进行琼脂糖凝胶电泳结果发现,SGC7901细胞经Ad-RA538处理2 d后染色体DNA发生断裂,2、4、6d电泳可见180～200bp不同倍体梯状DNA(DNA Ladder),DNA Ladder的出现有一定的时间效应,以6d时明显,Ad-LacZ处理组染色体DNA未见明显的DNA Ladder。②细胞凋亡原位末端标记(TUNEL)：细胞发生凋亡时,染色体DNA在核小体之间发生断裂,形成以核小体为单位的不同长度的DNA片断,同时产生多个3-OH末端,使用末端转移酶可将标记的dUTP连接在DNA片段的3-OH末端上,进行显色,从而显示凋亡细胞。Tunel检测法发现Ad-RA538可以使SGC7901细胞出现明显凋亡。Ad-LacZ处理的细胞未见凋亡。③流式细胞仪分析：SGC7901细胞分为Ad-RA538、Ad-LacZ及细胞对照组，以MOI100的感染强度感染腺病毒，分别于6、12、24h、2、4、6d收集各组细胞，经70%乙醇固定，PI染色等处理后，经FCM检测显示：Ad-RA538组12h G1期阻滞，4、6d S期及G2期阻滞，2d开始出现凋亡高峰，2、4、6d的凋亡峰分别为34.2%、18.2%、22%。Ad-LacZ组未见相应变化。结果见图2。
图2 Ad-RA538 感染后SGC7901细胞流式细胞仪分析
Fig 2 Flow cytometry analysis of SGC7901 cell infected with Ad-RA538 (A,B,C:Ad-LacZ or Ad-RA538 2d,4d,6d)
2.4 腺病毒介导RA538对胃癌细胞生长抑制作用的体内研究
2.4.1 裸鼠皮下致瘤实验 将经Ad-RA538及Ad-LacZ以MOI100的感染强度处理的SGC7901细胞,分别注射于3组裸鼠皮下,每组3只,每只注射107细胞/ml的细胞悬液100μl,另1组3只各注射PBS 100μl，结果显示，1月后Ad-RA538处理的SGC7901细胞裸鼠成瘤率为零,而Ad-LacZ及PBS处理组成瘤率为100%，见表1。
2.4.2 裸鼠皮下移植瘤模型的治疗实验 将SGC 7901细胞制成107细胞/ml的细胞悬液,以每只0.1ml的量分别注射于裸鼠皮下。待肿瘤长至5mm左右时取瘤体较为均一的20只裸鼠,随机分为4组,每组5只。分别瘤体内注射100μl Ad-RRA538、Ad-LacZ及PBS(Mock)。每4 d用卡尺测量瘤体大小,持续1月,根据公式计算肿瘤体积，见表2。Ad-RA538对裸鼠皮下移植瘤模型的治疗结果显示,1月后肿瘤小于对照组。对肿瘤生长的抑制率Ad-RA538为60.66%。
表1 Ad-RA538对SGC7901细胞裸鼠皮下致瘤实验结果
tab 1 Tumorigenicity assay in nude mice followAd-RA538 and Ad-ASc-myc
| Type of
virus infected |
Tumorigenicity/mice |
Tumorigenicity
(%) |
Weight of
tumors(g) |
| Ad-RA538 |
0/3 |
0 |
0 |
| Ad-LacZ |
3/3 |
100 |
0.947 |
| Mock |
3/3 |
100 |
0.580 |
表2 Ad-RA538对SGC7901细胞裸鼠皮下移植瘤模型的治疗实验结果
tab 2 In vivo experimental therapy of Ad-RA538on SGC7901 tumors in nude mice
| |
Tumor size (cm3) on different days |
| Type of
virus infected |
|
| |
0 |
4 |
8 |
12 |
16 |
20 |
24 |
28 |
| Ad-RA538 |
0.47 |
0.48 |
0.73* |
2.24* |
2.75** |
6.34** |
7.34** |
9.84** |
| Ad-LacZ |
0.39 |
0.95 |
2.76 |
5.89 |
9.73 |
14.25 |
17.65 |
20.60 |
| Mock |
0.36 |
0.86 |
2.12 |
5.87 |
10.25 |
14.89 |
17.90 |
25.01 |
*：P＜0.05，**:P＜0.01 vs Ad-LacZ or Mock
3 讨论
在肿瘤的基因治疗中，由于基因的转移主要采取将目的基因直接转移至宿主体内的方式，这就要求选择的载体具有高效转导、高效表达及安全等特点，只有这样才能满足临床肿瘤基因治疗的需要。为此，我们选择了腺病毒作为RA538基因的载体系统。在研究中发现，腺病毒转导效率高，能将目的基因转移到几乎100%的肿瘤细胞，MOI 25时，培养细胞的转导效率即高达90%以上。我们的实验显示Ad-RA538对SGC7901细胞有明显的生长抑制及凋亡诱导作用，原因之一可能与Ad-RA538对SGC7901细胞的高效转导有关。由于基因治疗所采用的体内方式要求采用的重组腺病毒需有较高的滴度，才能达到体内治疗对用药体积的要求。我们采取收集293细胞，反复冻融的方法，收集到的重组腺病毒滴度高达1011pfu/ml，使我们对裸鼠体内实体瘤的使用得以在有限的容积内达到病毒的有效治疗量，取得了较为满意的治疗效果。
胃癌的发生是多因素、多阶段及多基因变异的综合病变过程。多种癌基因及抑癌基因的异常累积是癌变过程中的重要机制［1，2］。据此重建抑癌基因功能成为目前胃癌基因治疗所追求的基本目标。基因治疗不同于单基因遗传病，除基因载体及导入手段外，目的基因的选择极为关键。选用抑癌基因RA538进行胃癌基因治疗的研究，主要基于如下考虑：①RA538是采用全反式维甲酸（RA）诱导人食管癌细胞系，经消减杂交法得到的抑癌基因，已有的研究表明RA538对恶性细胞具有广谱抑制作用［ 3，4 ］。②维甲酸对肿瘤细胞具有抑制生长及诱导凋亡作用［7,8］，而RA538具有与维甲酸类似的作用。③胃癌细胞中c-myc基因高表达，而RA538具有降调节c-myc的作用。我们将RA538基因以重组腺病毒介导，导入胃癌SGC7901细胞中，对细胞的生长、致瘤性及肿瘤生长均有十分明显的抑制作用。实验结果显示：Ad-RA538 对SGC7901生长抑制率达76.3%，克隆形成率为4.6%。并能使SGC7901细胞形成明显的DNA Ladder，原位末端标记及流式细胞仪检测均显示SGC7901细胞凋亡。体内实验显示，经Ad-RA538处理的胃癌细胞对裸鼠无致瘤性。裸鼠皮下肿瘤模型治疗实验显示Ad-RA538具有显著抑制肿瘤生长作用。以上结果表明Ad-RA538具有显著的抑制胃癌细胞恶性表达及诱导凋亡作用，导入关键的抑癌基因有可能通过阻止肿瘤细胞生长，诱导凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的。采用抑癌基因进行胃癌基因治疗的探索，国内外文献报告体外试验显示BCL-XS，Rb,p16，p53基因对胃癌细胞恶性增殖具有抑制作用［9，10］， Bouillet 等［11］报道使用消减杂交技术在p16胚胎细胞中发现了一个新的RA诱导基因Stra6，它在体外可以诱导肿瘤细胞凋亡，与RA538基因的作用一致。这些均表明抑癌基因的导入对胃癌细胞的生长具有一定的抑制作用。采用腺病毒介导RA538基因进行胃癌的基因治疗在国内外属首次尝试，体内与体外试验均取得了令人满意的效果。
本实验结果表明，Ad-RA538对c-myc基因高表达的SGC7901细胞生长有很强的抑制作用。Ad-RA538在用于胃癌基因治疗的方面具有良好的应用价值。Ad-RA538替代维甲酸用于肿瘤的分化治疗，可以避免维甲酸的临床毒副作用。由于腺病毒对人致病性小，宿主细胞广泛、滴度高等优点， Ad-RA538可望成为一种非常有前途的基因治疗药物用于肿瘤的临床治疗。
国家863计划资助项目，No.Z20-01-02
作者简介：陈洁平，女，36岁，主治医师，博士
作者单位：陈洁平 徐采朴 第三军医大学附属西南医院消化内科 重庆，400038
林晨 张雪艳 付明 邓友平 程金科 吴旻 中国医学科学院肿瘤研究所细
胞生物室 北京，100021
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