Fas基因转导逆转胃癌耐药细胞的作用及其机制分析
细胞与分子免疫学杂志 2000年第3期第16卷 肿瘤免疫学
作者：尹芳 赵伟平 时永全 肖冰 苗继延 樊代明
单位：尹芳（第四军医大学西京医院全军消化病研究所,陕西西安710032）；赵伟平（第四军医大学西京医院全军消化病研究所,陕西西安710032）；时永全（第四军医大学西京医院全军消化病研究所,陕西西安710032）；肖冰（第四军医大学西京医院全军消化病研究所,陕西西安710032）；苗继延（第四军医大学西京医院全军消化病研究所,陕西西安710032）；樊代明（第四军医大学西京医院全军消化病研究所,陕西西安710032）
关键词：Fas基因；胃癌；多药耐药性；基因转导；凋亡
摘要：目的观察Fas基因转导人胃癌耐药细胞SGC7901/VCR对化疗药物的敏感性，并初步探讨其机制。方法以流式细胞仪检测Fas基因转导和对照胃癌细胞在细胞周期中的分布；用MTT实验检查癌细胞对多种药物的敏感性；用免疫细胞化学染色法检测胃癌细胞P糖蛋白(Pgp)和拓扑异构酶II(TopoII)的表达。结果与胃癌细胞SGC7901和pBKSGC7901/VCR相比较,FasSGC7901/VCR在G2期减少，S期增多，并出现明显的凋亡峰；FasSGC7901/VCR对DDP，MMC和5Fu的敏感性增加，但对VCR和DOX的敏感性无明显变化；SGC7901，pBKSGC7901/VCR和FasSGC7901/VCRTopoII的表达无明显差别；FasSGC7901/VCRPgp的表达水平明显低于pBKSGC7901/VCR，仅显示弱阳性。结论Fas基因可在一定程度上逆转人胃癌耐药细胞SGC7901/VCR的多药耐药性(MDR)，其涉及的相关机制可能是增强细胞对凋亡诱导剂的敏感性，以及降低细胞Pgp的表达水平。
中图号：R730.2 文献标识码：A 文章编号：1007－8738(2000)03－0260－04
Drug sensitizing effect and related mechanisms of Fas gene transduction on human drug resis tant gastric cancer cell SGC7901/VCR
YIN Fang ZHAO Wei-ping SHI Yong-quan XIAO Bing MIAO Ji-yan FAN Dai-ming
（PLA Institute of Digestive Desease,Xijing Hospital,Fouth Military Medical University, Xi'an 710032,Shaanxi Province,China ）
Abstract： Aim To observe the drug sensitizing effect and related mechanisms of Fas gene transduction on human drug resistant gastric cancer cell SGC7901/VCR. Methods The cell cycle alteration， the sensitivity of gastric cancer cells to several anti tumor drugs and expression of P gp and Topo II in gastric cancer cells were detected by FCM, MTT assay and immunocytochemical staining,respectively. Results By comparing with SGC7901 and pBK SGC7901/VCR,Fas SGC7901/VCR cells decrease in the G2 stage and increase in the S stage, and obviously apoptotic peak arisen. Increased sensitivity of Fas SGC7901/VCR to DDP, MMC and 5 Fu;Topo II expression among SGC7901, pBK SGC7901/VCR and Fas SGC7901/VCR had no obvious differences;P gp expression level in pBK SGC7901/VCR was lower than that in SGC7901. Conclusion Fas gene transduction could reverse the multidrug resistance(MDR)of human drug resistant gastric cancer cell SGC7901/VCR, for which the higher sensitivity to apoptosis and decreased expression of P gp may be responsible.
Keywords: Fas gene； gastric cancer； multidrug resistance； gene transduction； apoptosis ▲
化疗是目前治疗肿瘤的主要途径之一。但由于肿瘤细胞可对抗癌药物产生多药耐药现象(MDR)，仍难达到满意的效果。近年研究表明，凋亡信息的抑制和细胞寿命的延长是产生多药耐药的机制之一〔1〕，因此，拟提出通过诱导或促进癌细胞凋亡来逆转其耐药的表型。本文中我们观察了导入促进凋亡的Fas基因的胃癌耐药细胞SGC7901/VCR中目的基因的表达，并从P-糖蛋白(P-gp)和拓扑异构酶II(TopoII)的表达水平，探讨了Fas基因逆转胃癌细胞耐药的可能机制。
1 材料和方法
1.1材料胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR由本所保存。Fas基因真核表达载体pBKCMV/Fas,Fas基因和空载体分别转导的胃癌耐药细胞株(FasSGC7901/VCR和pBKSGC7901/VCR)，由肖冰博士后构建。PMSF，Aprotinin，聚丙烯酰胺，ABC试剂盒，DAB显色液及DMSO等，购于华美生物工程公司和Promega公司。MTT和醋酸纤维素膜为Sigma公司产品。抗Fas,抗Pgp及抗TopoⅡ抗体均购于武汉博士德公司。阿霉素(DOX)为FarmitiliaCarloErbe公司产品。丝裂霉素C(MMC)为KyowaHakkoKogyo公司产品。长春新碱(VCR)为上海第十二制药厂产品。5氟尿嘧啶(5Fu)为上海旭东海普药业有限公司产品。顺铂(DDP)为山东齐鲁制药厂产品。
1.2方法
1.2.1耐药细胞Fas基因转导株的鉴定采用免疫印迹杂交分析。以三去污剂裂解细胞，制备Fas基因及空载体分别转导的FasSGC7901/VCR和pBKSGC7901/VCR株的膜蛋白。一半经SDSPAGE分离蛋白；另一半做免疫印迹，以SDS变性NC膜后，常规显色。
1.2.2癌细胞对药物敏感性的检测(1)取对数生长中期的3种癌细胞(SGC7901，FasSGC7901/VCR和pBKSGC7901/VCR)，接种于96孔板中(每孔5×103个/100μL)，置37℃培养12h。当细胞生长状态良好时，按正常血药浓度的0.1,1,10和100倍(或20倍)分别加入药物(DDP,MMC,VCR和5Fu)，每孔终体积为200μL。每种设3个复孔，并设不加药物的空白对照。继续培养72h后，每孔加入50g/LMTT20μL再培养4h。弃上清，加DMSO150μL/孔，轻振10min，用ELISA仪于490nm处测定每孔的吸收(A)值，并按下式计算不同药物浓度下癌细胞的存活率：
癌细胞存活率(％)=(实验孔A值/对照孔A值)×100％
1.2.3细胞周期测定将SGC7901，FasSGC7901/VCR和pBKSGC7901/VCR常规传代培养。待细胞生长至对数中期，用胰酶(2.5g/L)消化并收集，盐水洗涤2次后，于4℃离心(800r/min)10min。取细胞，用700mL/L乙醇4℃固定过夜。测定前,再以盐水洗2次，用0.5mL碘化丙啶(PI)染色15min后，做流式细胞仪分析。
1.2.4Pgp和TopoII表达的检测制备培养的SGC7901，FasSGC7901/VCR和pBKSGC7901/VCR的爬片，并用冷丙酮固定。加3mL/L甲醇于室温封闭30min，PBS振洗3次×5min，再以含100mL/L山羊血清的PBS室温封闭30min，分别滴加1∶1000抗Pgp和抗TopoIImAb(对照组加适当稀释度的正常小鼠血清)，4℃过夜。再于37℃1h，PBS振洗3次×5min。依次滴加1∶50生物素化的抗小鼠IgG(37℃作用40min，同上振洗)，1∶50AB复合物(同上孵育、振洗)及DAB显色(室温避光10～15min)。再以苏木素复染、常规脱水、透明，中性树脂胶封片。
2 结果
2.1Fas基因的表达Fas转导株与空载体转导株的SDSPAGE条带无显著差别。但免疫印迹显示，转导株在相对分子质量(Mr)为36000～40000处较空载体转导株多出现1条带，大小与Fas蛋白的Mr相符。转导株的转膜蛋白，在相应位置出现明显的印迹着色，而非转导株仅有微弱的表达(图1)。
图1Fas的SDSPAGE及免疫印记杂交分析
Fig 1 SDS PAGE and Weston blot of Fas in three kinds of cell lines A: SDS PAGE; B: Weston blot; 1, 4:Total protein (100 μ g)extracted from pBK SGC7901/VCR and Fas SGC7901/VCR respectively; 2,5: Total protein(150 μ g)extracted from pBK SGC7901/VCR and Fas SGC7901/VCR respectively; 3: Marker(Mr× 103).
2.2癌细胞对药物的敏感性与pBKSGC7901/VCR相比较，FasSGC7901/VCR对DDP，MMC和5Fu的敏感性明显增加(P≤O.O5，图2)，而对VCR和DOX的敏感性无明显变化(P≥0.05)。
2.3细胞周期的分析FasSGC7901/VCR在G1/
0,G2,S期的比例分别为：0.70，0.06和0.24；pBKSGC7901/VCR分别为：0.67,0.17和0.13。3种细胞在G1期的比例无明显差异，但Fas-SGC7901/VCR在S期的分布增多，为pBK-SGC7901/VCR的1.9倍；G2期减少，为pBK-SGC7901/VCR的0.33倍；并出现明显的凋亡峰(凋亡细胞为7.7％)。
2.4Fas对耐药细胞表达P-gp和TopoII的影响
pBK-SGC7901/VCR和SGC7901均表达P-gp，但前者明显强于后者；而FasSGC7901/VCR对P-gp的表达明显减弱或不表达(图3)。3种癌细胞对TopoII的表达呈中等水平。
图23种癌细胞经不同剂量的化疗药物处理后的存活率(％)
Fig 2 Survival rates of three kinds of cancer cells treated with chemotherapeutic drugs (％ ) aP∨ 0.05 vs Fas SGC7901/VCR.
图3免疫细胞化学染色检测3种癌细胞中P-gp的表达
Fig 3 P gp expression in the 3 tumor cells lines by immunocytochemical staining(× 400) A: pBK SGC7901/VCR; B: SGC7901; C: Fas- SGC7901/VCR.
3 讨论
Fas基因在肿瘤细胞的凋亡中具有重要作用。细胞膜表面的Fas分子与FasL或其抗体结合后，可向细胞内传递死亡信号，在数小时内死亡。但癌细胞Fas的表达水平异常低下，发生转移的癌组织几乎不表达。Fas在胃癌及癌旁组织中均有不同程度的表达，但后者表达的阳性率明显高于前者。另外，Fas＋的胃癌及癌旁组织中，凋亡指数均高于Fas－的组织〔1〕。为研究Fas基因与肿瘤细胞MDR的关系，我们将Fas基因转导入耐VCR的SGC7901/VCR〔3〕中。发现FasSGC7901/VCR在G2期减少、S期增加，并出现明显的凋亡峰。另外，该细胞对DDP，MMC和5Fu的敏感性增加，与急性髓样白血病患者Fas表达的阳性率同化疗效果呈正比的结果相一致〔4〕。
在本研究中，Fas基因逆转SGC7901/VCRMDR的机制可能与下列因素有关：(1)Fas基因增加了转导细胞对凋亡诱导的敏感性。本实验发现，Fas基因转导细胞出现自发性凋亡(如流式细胞仪检测出现凋亡峰)。(2)Fas基因产物可能通过降低Pgp的表达增强肿瘤细胞对药物的敏感性。本文中免疫细胞化学染色说明，Fas基因转导细胞Pgp的表达明显低于空载体转导细胞和药物敏感细胞,提示Fas蛋白可能与Pgp之间存在着信号交联。但Fas基因转导引起细胞Pgp表达下降的具体机制还有待进一步研究。
阿霉素(doxorubicin或adriamycin)和柔红霉素(daunorubicin)均为蒽环类抗癌药物，可与TopoII结合并水解ATP，诱导DNA断裂，从而妨碍转录，抑制DNA和RNA的合成。已证实TopoII导向的化疗药物，可通过引发细胞凋亡而导致针对多种肿瘤的细胞毒作用。本文中FasSGC7901/VCR对DDP，MMC和5Fu的敏感性增高；而对DOX和VCR的敏感性无明显变化，提示Fas并不能增强所有TopoII导向的化疗药物的敏感性。前以提及，TopoII的活性在SGC7901/VCR中较在SGC7901中降低，而免疫细胞化学染色显示，3组癌细胞TopoII的表达水平则无明显差别，说明SGC7901/VCR可能是通过降低TopoII的活性而非降低其表达水平引起MDR。
总之，肿瘤细胞MDR的发生是一个复杂的过程，包含了多种机制的参与。我们的结果有助于对胃癌细胞耐药机制的了解，并为利用诱导细胞凋亡来逆转肿瘤细胞的MDR做了有意义的探索。但由于体外实验的条件与体内环境差别很大，是否可通过在体内诱导凋亡而用于肿瘤MDR的逆转及治疗，尚需要做更多的研究。■
基金项目：国家自然科学基金资助，No.3988007
作者简介:尹芳,女,26岁,硕士生,通讯作者西安市长东西路15号,Tel.(029)3375229 Email.fangyin@hotmail.com 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
参考文献：
〔1〕 Friesen C, Fulda S, Debatin KM. Deficient activation of the CD95 (APO 1/Fas) system in drug resistant cells〔J〕 . Leukemia, 1997; 11(11): 1833－ 1841.
〔2〕 刘 海 峰 ， 刘 为 纹 .胃 癌 和 癌 旁 组 织 中 Fas抗 原 的 表 达 与 细 胞 凋 亡 的 关 系 〔J〕 .华 人 消 化 杂 志 , 1998; 6(4):321－ 322.
〔3〕 Xiao B, Shi YQ, Zhao YQ, et al. Transduction of Fas gene or bcl 2 antisense RNA sensitizes cultured drug resistant gastric cancer cell to chemotherapeutic drugs〔J〕 . WJG, 1998; 4(5): 421－ 425.
〔4〕 Min YH, Lee S, Lee J, et al. Expression of Fas antigen in acute myeloid leukemia is associated with therapeutic response to chemotherapy〔J〕 . Br J Haematol, 1996; 93(4): 928－ 930.
收稿日期:1999-12-24
修稿日期:2000-02-25
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