抗胃癌单克隆抗体识别的噬菌体呈现肽与天然抗原的关系
细胞与分子免疫学杂志 2000年第2期第16卷 分子免疫学
作者：徐立 金伯泉 樊代明
单位：徐立（第四军医大学西京医院消化病研究所）；金伯泉（免疫学教研室，陕西西安710032）；樊代明（第四军医大学西京医院消化病研究所）
关键词：胃癌相关抗原；抗原模拟；噬菌体表面呈现；；竞争抑制
中图号：R392.11R735.2 文献标识码：B
文章编号：1007－8738(2000)02－0119－02
噬菌体呈现的随机肽库已成功地用于筛选B细胞或T细胞表位。为进一步研究胃癌相关抗原与相应单克隆抗体(mAb)结合的结构基序及其相互作用，我所通过两株胃癌mAbMG7和MGb2筛选噬菌体呈现的随机九肽库，获得一些可与mAb结合的噬菌体呈现肽。我们采用竞争抑制实验，研究了这些肽与天然胃癌相关 抗原的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 胃癌mAbMG7和MGb2由本所研制[1，2]，通过筛选噬菌体呈现的随机九肽库[3,4]，获得可与相应mAb结合的噬菌体呈现肽[5，6]。
1.2 方法
1.2.1 噬菌体呈现肽竞争抑制试验 将纯化的噬菌体分别与相应的mAb4℃孵育过夜。然后在ELISA酶标板中，加入表达胃癌相关抗原MG7和MGb2的KATOIII胃癌细胞（1×104/孔），用丙酮－福
尔马林固定液固定30s，再加入含50g/LBSA的10mmol/LPBS（pH7.4），37℃封闭2h。每孔中分别加入噬菌体与mAb的混合液100μL，37℃孵育30min，用PBST/PBS洗板。依次加入生物素－抗鼠二抗及亲和素与HRP标记的生物素复合物，常规孵育和洗涤。最后以TMB显色、2mol/LH2SO4终止反应。在酶标仪上读取波长450nm的A值。同时设阴性对照1孔(加入纯化的非重组噬菌体与mAb预孵的混合物)，阳性对照1孔(加入细胞与mAb预孵的混合物)，及无 竞争抑制1孔(即直接加入抗体)。
抑制率(％)=〔(无竞争抑制孔A450nm值－竞争抑制孔A450nm值)/无竞争抑制孔A450nm值〕×100％
1.2.2 肿瘤细胞竞争抑制试验 用纯化的mAbMG7和MGb2分别包被聚乙二烯珠子，封闭后加不同稀释度的胃癌细胞KatoIII和阳性噬菌体颗粒，并以空载体作为阴性对照，于37℃孵育2h。以PBST/PBS反复洗涤后，用酸洗脱法回收与mAb结合的噬菌体，感染宿主菌，计算克隆形成数(cfu)。
2 结果
噬菌体呈现的抗原模拟肽对天然抗原与胃癌mAb结合的抑制率在50％～80％之间，见表1和图1；天然抗原则可完全抑制模拟肽与胃癌mAb的结合。结果还提示，当模拟肽与各自相应的mAb孵育时，随着细胞密度的增加，与mAb结合的噬菌体数目逐渐减少，见表2和图2；而当呈现肽与非相应mAb孵育时，mAb结合 的噬菌体数目与细胞的密度改变无关。
表1 噬菌体呈现肽ELISA竞争抑制试验A450nm值
| mAb |
无竞争 |
阳性 |
阴性 |
克隆1 |
克隆2 |
| MG7 |
1.397 |
0.119 |
1.219 |
0.483 |
0.366 |
| MGb2 |
1.126 |
0.106 |
1.008 |
0.479 |
0.506 |
表2 肿瘤细胞竞争抑制试验的洗脱克隆数
| 细胞数 |
空载体 |
G*-MG7 |
B*-MGb2 |
G-MGb2 |
B-MG7 |
| 1×102 |
63 |
9.6×104 |
3.5×104 |
85 |
77 |
| 1×103 |
58 |
3.2×104 |
8.6×103 |
102 |
60 |
| 1×104 |
69 |
8.0×103 |
5.2×103 |
97 |
66 |
| 1×105 |
64 |
4.2×103 |
7.9×102 |
83 |
50 |
| 1×106 |
45 |
96 |
88 |
75 |
54 |
*G，B分别代表与mAbMG7和MGb2结合的噬菌体呈现肽.
图1 噬菌体呈现肽竞争抑制试验的抑制率
图2 肿瘤细胞与阳性噬菌体的竞争抑制试验
3 讨论
肿瘤相关抗原与正常细胞上抗原分子十分相似，应用mAb技术可区别二者之间的细微差异。那么体现这种差异的分子是什么呢？鉴于肿瘤抗原的研究正由天然蛋白大分子向亚单位、表位多肽过渡[7，8]，我们通过用胃癌mAbMG7和MGb2筛选噬菌体呈现的随机九肽库，已获得一些可与mAb结合的噬菌体呈现肽。为进一步明确噬菌体呈现肽与细胞表达的天然胃癌抗原间的关系，我们采用竞争抑制实验进行了探讨。结果提示，噬菌体呈现肽与mAb的结合位点，位于细胞表面天然抗原与mAb结合位点之中，而且两株mAb识别的表位之间无交叉反应。
基金项目：国家杰出青年基金,No.39525020
作者简介：徐立，女，30岁，博士生，西安市长乐西路15号,Tel.（029）3375227
参考文献：
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收稿日期：1999－05－28
修回日期：1999－08－23
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