S100A4蛋白表达与胃癌侵袭转移关系的研究^＊

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第8期

孙秀菊　王舒宝　赵彦艳　徐惠绵　李福才　孙开来

　　摘　要　目的：探讨S100A4蛋白表达水平与胃癌侵袭转移的关系。方法：应用免疫组织化学方法检测62例胃癌患者的胃癌组织和38例癌旁正常粘膜、23例淋巴结转移癌及胃癌细胞系MKN45、BGC823中S100A4蛋白表达，Boyden小室法检测胃癌细胞侵袭能力。结果：胃癌组织S100A4表达阳性率(70.96％)显著高于癌旁正常粘膜(15.79％)(P＜0.01).在弥漫生长、低分化及未分化型、浸透浆膜、淋巴结转移阳性及淋巴结多数转移(＞5个)的胃癌中,S100A4表达阳性率增高更明显(P＜0.01或P＜0.05),淋巴结转移癌中S100 A4表达阳性率(100%)显著高于相应原发灶(73.91%)(P＜0.05),MKN45细胞侵袭力显著高于BGC823细胞,其S100 A4表达水平亦显著高于BGC823细胞(P＜0.01)。结论:胃癌组织、细胞中S100 A4表达增强与胃癌侵袭转移有关。

　　 　　关键词：胃肿瘤　S100A4　侵袭　转移

　　胃癌的发病率及死亡率在我国居各种恶性肿瘤之首，侵袭转移是胃癌治疗失败和患者死亡的主要原因，已知许多基因及其产物在引发肿瘤侵袭转移表型中具有重要作用。S100A4是从转移性小鼠乳腺癌细胞中分离出的一种转移相关基因^[1]，S100A4又称CAPL、p9ka、mts1^[2～4],mts1即metastasin,它与MTS1(p16)同名异意。S100A4基因编码产物是Ca^2＋结合蛋白S100家族的成员，S100A4表达水平与小鼠乳腺癌细胞侵袭转移能力呈正相关^[1]，近年研究表明，它的表达也与人乳腺癌细胞的侵袭能力呈正相关^[5]，S100A4与胃癌侵袭转移关系的研究国内外尚未见报道。本文报告了S100A4在人胃癌组织、转移淋巴结及人胃癌细胞系中的表达，旨在探讨S100A4与胃癌侵袭转移的关系，为胃癌侵袭转移的诊治提供理论及实验依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　一般资料

　　1.1.1　材料　取1997～1998年中国医科大学第一临床学院肿瘤科胃癌手术切除标本，其中胃癌组织62例，癌旁正常粘膜38例，淋巴结转移癌23例。所有患者术前均未接受化疗或放疗。标本经福尔马林固定及石蜡包埋，连续5μm切片每份2张，分别进行HE染色及组化染色。每例标本均按日本《胃癌处理规约》^[6]标准进行系统病理学检查。

　　1.1.2　主要试剂及用品　S100A4多克隆抗体由瑞士Zurich大学儿科系临床化学研究室Dr.Heizmann馈赠^[2],微孔滤膜为美国Nuclepore公司产品,基底膜胶为Bectondickinson产品。免疫组化S－AP试剂盒购自福州迈新生物技术公司。

　　1.2　实验方法

　　1.2.1　细胞培养　人胃癌细胞系MKN45（日本理化研究所横山和尚教授馈赠）、BGC823细胞、NIH3T3细胞常规传代培养。

　　1.2.2　侵袭实验　参照Albin^[7]等方法，用1mg/ml的基底膜胶铺盖于8μm的微孔滤膜上，小室下室加入趋化剂（无血清培养24小时的NIH3T3细胞条件培养基），加盖上述已铺好胶的滤膜，将2×10⁵的MKN45、BGC823细胞悬液加到上室内，培养6小时，取出滤膜，显微镜下以棉棒拭去滤膜上表面的细胞，甲醇固定，HE染色，光镜(×400)下计数膜背面的细胞数。

　　1.2.3　细胞爬片方法　将各实验组细胞制成密度为1×10⁵/ml的悬液，接种于直径10cm的培养皿中，皿内预置盖玻片，72小时后吸去培养液，甲醛固定，待免疫组化染色。

　　1.2.4　免疫组化染色法　第一抗体为抗S100A4多克隆抗体,用含4％奶粉的1640稀释，工作浓度为1:40；以S100A4抗原预处理的抗S100A4抗体代替第一抗体作阴性对照^[8](图1)，参照S－AP试剂盒说明书进行免疫组化染色，AP－RED显色，以细胞内出现红色颗粒为阳性(图2,3)。对组织标本参照Shimizu^[9]方法，根据染色的强度和阳性细胞分布积分，按积分之和进行评定，2分及2分以下者为S100A4表达阴性，3分及3分以上者为S100A4表达阳性。胃癌细胞S100A4表达水平采用Luzex－F半自动图像分析仪进行分析定量。S100A4含量和灰度值呈反比关系。

图1　阴性对照×400

图2　S100A4在高分化胃癌中的表达×400

图3　S100A4在转移淋巴结中的表达×400

　　1.2.5　统计学处理　采用χ²检验及t检验（P＜0.05有统计学意义)。

　　2　结果

　　2.1　S100A4表达的特征

　　在胃癌原发灶、淋巴结转移癌及胃癌细胞系中，免疫组织化学显示S100A4表达为红色颗粒，主要定位于胞浆内，少量位于胞核或胞膜。

　　2.2　胃癌组织S100A4表达水平与病理生物学行为的关系

　　胃癌组织S100A4阳性表达率70.96％(44/62)显著高于癌旁正常粘膜阳性表达率15.79％(6/38)(P＜0.01),分组统计发现,弥漫状生长、低分化、未分化型及浸透浆膜组胃癌的阳性表达率显著增设(P＜0.01),但其表达与肿瘤大小及外科分型无明显关系(表1)。

表1　S100A4表达与胃癌临床病理的关系　例(％)

　　＊P＜0.01

　　2.3　S100A4表达与胃癌淋巴结转移的关系

　　结果显示，淋巴结转移阳性及淋巴结多数转移(5个以上)胃癌S100A4阳性表达率显著增高(P＜0.01或P＜0.05),淋巴结转移癌S100A4阳性表达率100%(23/23)显著高于相应胃癌原发灶的表达率73.91%(17/23)(P＜0.05)(见表2)。

表2　S100A4表达与胃癌淋巴结转移的关系例(％)

　　＊P＜0.05　＊＊P＜0.01

　　2.5　胃癌细胞体外侵袭力与S100A4表达的关系

　　胃癌细胞体外侵袭力以侵入滤膜细胞数来判定。可见MKN45细胞体外侵袭力显著高于BGC823细胞，MKN45细胞S100A4表达水平亦显著高于BGC823细胞(表3)。

表3　胃癌细胞侵入滤膜数量与S100A4表达水平对比

　　＊P＜0.01

　　3　讨论

　　实验证明，S100蛋白类可调节细胞各种功能，包括细胞生长、细胞间通讯联系、细胞收缩及细胞信号传导等^[10]。S100A4蛋白与非肌肉的肌球蛋白相互作用^[11]，因而增加细胞的运动能力，促进侵袭转移，另外它也可能通过影响细胞骨架而调节细胞粘附，或通过细胞信号传导系统而影响肿瘤细胞侵袭转移能力。近年来，对S100A4的研究日益深入，将S100A4基因转染至大鼠良性乳腺上皮细胞系后，使其获得转移表型^[3]；将S100A4基因转染至侵袭转移能力很低的人乳腺癌细胞系MCF－7中后，其侵袭转移能力显著增强^[4]；反义S100A4RNA处理可抑制小鼠肿瘤细胞的转移能力^[12]。研究表明^[5]，人乳腺癌中S100A4表达水平与尿激酶型纤溶酶原激活物（UPA）的表达呈显著正相关，而UPA是乳腺癌高侵袭性的标志，可见S100A4与乳腺癌的高侵袭性有关。

　　我们首次检测了胃癌标本、淋巴结转移癌及胃癌细胞系中S100A4的表达。研究结果显示，胃癌组织S100A4表达显著高于癌旁正常粘膜，提示胃上皮细胞癌变后，S100A4表达上调，对乳腺癌的研究也证实，乳腺癌组织S100A4表达高于癌旁正常粘膜^[5]；S100A4在弥漫性生长、低分化、未分化及浸透浆膜组胃癌中阳性率显著增高，证明恶性度高的胃癌，其侵袭性强、浸润扩散严重，可能与S100A4功能增强有关。

　　胃癌细胞系的研究结果显示，细胞体外侵袭力较高者其S100A4表达水平亦较高，从细胞水平进一步表明S100A4高表达与胃癌的高侵袭性有关。其机制尚不清楚，有待进一步研究。我国早期胃癌的诊断率很低，90％以上患者确诊时已是进行期胃癌，多有淋巴结转移，因此临床上不仅应分析淋巴结转移的有无，还应关注其转移严重程度，以更客观地判断患者的预后。本研究就S100A4表达与胃癌淋巴结转移的关系作了初步探讨。分析表明，在淋巴结转移阳性及转移数目较多者（5个以上），其原发灶S100A4阳性率显著增高，即S100A4表达的增强，与淋巴结转移的发生及淋巴结转移严重程度有关。本实验结果还显示，23例淋巴结转移癌S100A4阳性率显著高于相应原发灶中S100A4阳性率。逐例分析发现，23例原发灶中6例S100A4表达阴性者，仍有少数癌细胞表达S100A4,但综合评分低于阳性标准，可能正是这些表达S100A4的少数细胞转移到淋巴结或其它部位进而增殖形成转移癌，转移癌中S100A4呈阳性表达。

　　由上可见，S100A4表达的检测在评价胃癌侵袭性、浸润深度及淋巴结转移方面有一定临床价值。

　　(致谢:感谢中国医学科学院肿瘤医院免疫室罗利群老师在实验方面给予的支持和帮助)

　　＊本文课题受卫生部直属机构重点项目基金及辽宁省自然科学基金资助(962309)

　　作者单位：孙秀菊　赵彦艳　李福才　孙开来　中国医科大学分子遗传研究室（沈阳市110001）；王舒宝　徐惠绵　中国医科大学第一临床学院肿瘤科

参考文献

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　　2　Pedrocchi M,Schafer BW, Durussel I,et al. Purification and characterization of the recombinant human calcium－ binding S100 proteins CAPL and CACY.Biochemistry,　1994;33:6732

　　3　Davies BR, Davies MP, Gibbs FE,et al.Induction of the metastatic phenotype by transfection of a benign rat mammary epithelial cell line with the gene for p9ka,a rat calcium－binding protein,but not with the oncogene EJ－ras－1.Oncogene,1993;　8:999

　　4　Grigorian M,Ambartsumian N,Lykkesfeldt AE,et al. Effect of mts1(S100A4)expression on the progression of human breast cancer cells. Int J Cancer，1996； 67:831

　　5　Pedrocchi M,Schafer BW,Muller H.et al. Expression of Ca(2＋)－ binding proteins of the S100 family in malignant human breast cancer cells and biopsy samples. Int J Cancer,1994;57:684

　　6　胃癌研究会.胃癌取扱い规约.第12版，东京：金原，1993.8

　　7　Albin A, Iwamoto Y, McEwan RN. A rapid in vitro assay for quantitating the invasion potential of tumor cell. Cancer Res,1987;47:3239

　　8　Ilg EC, Schafer BW,Heizmann CW. Expression pattern of S100 calcium－ binding proteins in human tumors. Int J Cancer,1996;68:325

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　　10　Zimmer DB,Cornwall EH,Landar A,et al.The S100 protein family:histry ,function and expression.Brain Res Bull,1995;37:417

　　11　Ford HL,Zain SB. Interaction of metastasis associated Mts1 protein with nonmuscle myosin. Oncogene,1995;10:1597

　　12　Grigorian MS, Tulchinsky EM, Zain S,et al.The mts1 gene and control of tumor metastasis. Gene,1993;135:229