人胃癌组织中金属蛋白酶类基因的过度表达

世界华人消化杂志 1998年第2期第0卷 研究原著

作者：李楠^1,2　徐采朴¹　宋波¹　房殿春¹　杨仕明¹　门荣莆¹

单位：1第三军医大学西南医院消化科　重庆市　430038;2海军总医院消化科　北京市　100037

关键词：胃肿瘤/遗传学；金属硫蛋白/遗传学；基因表达

Overpression of matrix metalloproteinases gene in human gastric

　　carcinoma

　　lI Nan^1,2, XU Cai-Pu^１, SONG Po^１, FANG Dian-Chun^１, YANG Shi-Ming^１ and MENG Rong-Pu^１1Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Millitary Medical University, Chongqing 430038, China

　　²Department of Gastroenterology, Chinese PLA Navy General Hospital

　　Subject headings　stomach neoplasms/genetics; metallothionein/genetics; gene expression

　　Abstract

　　AIM　To evaluate the relationship of overpression of metalloproteinases (MMP-2, MMP-9 and MT-MMP) in gastric carcinoma.

　　METHODS Immunohistochemitry (SP-A methods) and in situ hybridization(cDNA-mRNA) were used to detect MMP-2, MMP-9 and MT-MMP gene expression in tissues of human gastric carcinoma (HGC) and nearby non-tumorous tissues (NT).

　　RESULTS The positive rates of MMP-2 and mT-MMP were 73.1% (30/41), 65.8%(27/41) and 22.5%(4/17), 41.1%(7/17) in HGC and NT. The positive rates of MMP-2, MMP-9 and MT-MMP were 70.7%(29/41), 51.2%(21/41), 56.0%(23/41) and 23.5%(4/17), 23.5%(4/17), 35.2%(6/17) in HGC and NT, respectively. The expression of MMP-2 and mT-MMP at protein level was significantly correlated with that at mRNA level.

　　CONCLUSION MMP-2, MMP-9 and mT-MMP gene overexpression is involved in gastric carcinogenesis. Immunohistochemisitry is a reliable method for detecting MMP-2, MMP-9 and mT-MMP gene expression in HGC.

　　中国图书资料分类号　R735.2

　　摘　要

　　目的　探讨组织金属蛋白酶家族成员在人胃癌组织中的表达.

　　方法　应用免疫组织化学(SP法)和原位杂交(cDNA-mRNA)技术对41例人胃癌17例癌旁组织中的金属蛋白酶MMP-2，MMP-9及MT-MMP基因表达进行检测.

　　结果　MMP-2及MT-MMP蛋白在胃癌及癌旁组织阳性率分别为73.1%(30/41)，65.8%(27/41)和22.5%(4/17)，41.1%(7/17). 胃癌及癌旁组织MMP-2，MMP-9及MMP-MT mRNA阳性率分别为70.7%(29/41)，51.2%(21/41)，56.0%(23/41)和23.5%(4/17)，23.5%(4/17)，35.2%(6/17). 一致性检验显示基因的免疫组化和原位杂交检验结果的关系密切(P＜0.05).

　　结论　MMPs基因的过度表达参与了胃癌的发生发展过程，MMPs的免疫组化是检测胃癌组织侵袭、转移倾向的可靠方法.

　　0　引言

　　侵袭和转移是恶性肿瘤主要的生物学特征之一. 肿瘤细胞在穿越组织天然屏障向身体远隔部位移动的过程中需产生或诱导产生蛋白酶类以降解细胞外基质. 已证明基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases, MMPs)对肿瘤的侵袭和转移起着极为重要的作用^［1］. Ⅳ型胶原酶(包括Mr 92 000和72 000二个亚型)、以及新近发现的Ⅳ型胶原酶的前体膜型金属蛋白酶(MT-MMP)是金属蛋白酶类的主要成员. 我们应用免疫组织化学和原位杂交技术检测人胃癌及癌旁组织中Ⅳ型胶原酶及前体膜型胶原酶的mRNA及蛋白表达水平，以探讨其在胃癌侵袭和转移过程中的意义.

　　1　对象和方法

　　1.1　对象　所用标本取自本院1994-06/1997-01手术切除胃癌41例，其中17例带有癌旁组织. 男33例，女8例，年龄29岁～68岁，平均年龄43.7岁. 作对照组的正常胃组织取自内镜标本. 新鲜组织离体后30min内液氮速冻，或－70℃保存备用.

　　1.2　方法

　　1.2.1　MMPs　cDNA探针MMP-2，MMP-9及MT-MMP cDNA由美国马里兰州国家癌症中心病理研究室Stetler-Stevenson博士惠赠. 分别构建于PSG-5， bluscript及pGEM-4Z载体中，经酶切鉴定正确后回收cDNA片段，应用地高辛随机引物法标记探针，步骤根据Boehringer Mannnheim公司试剂盒进行.

　　1.2.2　原位杂交操作流程　按蔡文琴^［2］方法进行. 冰冻切片经冷风吹干后，经① 0.01mol/L PBS漂洗，甘氨酸/PBS-Triton-100/PBS洗，蛋白酶K消化，37℃ 30min. 40g/L多聚甲醛/PBS后固定，2×SSC漂洗后进行杂交(杂交液成分：0.5kg/L去离子甲酰胺；0.1kg/L葡萄糖硫酸脂；1 Denhardts液；10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；0.3mmol/L NaCl；1mmol/L EDTA pH 8.0；变性蛙鱼精DNA 0.25/L；10mmol/L DTT；MMP-2；MMP-9及MT-MMP cDNA探针(1～2)mg/L，每张切片加 (25～50)μl杂交液，杂交温度设置在(42～50)℃，12h～16h. 梯度洗脱液漂洗(4×SSC，含RNaseA的2×SSC，1×SSC；0.05mol/L PBS). 碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体Fab片段(Boehringer Mamheim)，1∶1000稀释，室温过夜PBS洗，洗脱液Ⅰ，Ⅱ洗后，NBT显色，终止反应、封片.

　　1.2.3　免疫组化观察　MMP-2及MT-MMP单克隆鼠抗体体系由日本Kannazama大学癌症研究所Sato博士赠送，抗体滴度分别为1∶150和1∶300. 二抗及显色试剂使用福州迈新生物公司SP即用型试剂盒，按染色范围及强度判断染色结果.

　　1.2.4　阴性对照设置　原位杂交：①杂交前用RNase 100mg/L，37℃ 1h预处理组织切片；②于相应探针MMP-2,MMP-9及MT-MMP cDNA杂交后再次重复杂交染色. 阴性对照用TBS代替Ⅰ抗或Ⅱ抗作为阴性对照.

　　统计学处理　免疫组织化学与原位杂交结果与转移倾向的相关性统计学处理用小样本精确概率软件计算机进行.

　　2　结果

　　2.1　免疫组织化学　①MMP-2：阳性物质位于胞浆和大部分组织间质内，41例胃癌中21例阳性物质主要分布于癌巢的边缘，部分呈散在性分布，17例癌旁组织中有4例阳性，两者强度比较：4例均为阳性，且3例癌组织强于癌旁组织，1例两者相近；②MT-MMP：阳性物质亦位于胞浆，其分布在胃癌组织内肿瘤细胞内较多，而癌旁实质细胞含量少，而且多分布于间质细胞，与肿瘤细胞的分布不同. 在肿瘤组织阳性表达中亦见或巢状或灶状分布. 与癌旁组织比较阳性表达均强于其.

　　2.2　原位杂交　①MMP-2 mRNA 41例胃癌中29例阳性，17例癌旁组织中有4例阳性. 大部分实质细胞见有MMP-2阳性表达，而正常胃粘膜细胞大多呈阴性，且间质细胞阳性表达在正常与胃癌组织中均有阳性表达，而且染色强度相近；②MMP-9 mRNA：分布与MMP-2基本一致，其中正常胃粘膜细胞表达阴性，而间质细胞在癌旁组织及正常腺体组织中均有部分阳性表达；③MT-MMP mRNA：蓝色阳性反应细胞在癌组织分布不均匀，显色亦深浅不一，在癌巢边缘部分及腺体上皮细胞中多显色较深，胃微绒毛基底部阳性细胞量多，而粘膜下近肌层者明显减少. 正常胃粘膜上皮细胞含量少或缺如.

　　2.3　胃癌组织两法检测结果比较　①一致性检测结果比较(χ²)发现胃癌组织MMP-2及MT-MMP基因免疫组化与原位杂交结果关系密切，P=0.0196(精确法)，41例中两者结果一致者占61.9%(25/41)，同时发现两法的差异未达到显著界限(P＞0.05). ②一致性检验(χ²)发现胃癌组织MT-MMP基因免疫组化与原位杂交结果关系密切，χ² c=3.925，P＜0.05，41例中两法一致者占56.0%(23/41). 同时发现两法的差异未达到显著界限(P＞0.05).

　　2.4　MMP-2，MMP-9及MT-MMP基因与胃癌浸润程度及淋巴结转移的关系　尽管管状腺癌和低分化腺癌MMPs的阳性率较高，但尚未见统计学差异. MMP-2，MMP-9及MT-MMP阳性染色与肿瘤浸润程度呈正相关(P=0.362，P＜0.05)，即侵及胃浆膜层和网膜的胃癌细胞MMP-2/-9及MT-MMP阳性率最高. MMP-2过表达与胃癌淋巴结转移也呈显著相关，MMP-3阳性肿瘤的淋巴结转移率(64.0%)明显高于MMPs阴性的肿瘤(33.0%)，表1.

　　表1　MMP-2，MMP-9及MT-MMP mRNA表达与临床病理学特征

　　3　讨论

　　恶性肿瘤的侵袭与转移，涉及肿瘤细胞与宿主之间错综复杂的关系，受多种相关基因的调控. 基质金属蛋白酶是参与细胞外基质降解活动的主要蛋白类之一. 其中Ⅳ型胶原酶的二个亚型(MMP-2，MMP-9)在多种肿瘤组织中均有阳性表达，但由于二者作用的基质不同则表达的程度有差异. mT-MMP是Ⅳ型胶原酶的前体，亦称膜型金属蛋白酶，不仅可降解细胞外多种基质成分，而且参与金属蛋白酶类激活的过程，通过其本身激活间质及基质胶原酶^［3］. 目前在多种肿瘤组织如乳腺癌、肺癌、黑 色素瘤、前列腺癌^［4，5］中发现MMP-2，MMP-9及MT-MMP不同程度表达. 但三者综合研究并共同在胃癌中的表达未见报道.

　　我们应用免疫组化方法研究MMP-2和MT-MMP蛋白表达变化在胃癌浸润和淋巴结转移中的作用，发现MMP-2，MT-MMP过度表达与胃癌的浸润深度和淋巴结转移具有显著的相关性. 本实验发现在人胃癌组织中MMP-2，MMP-9及MT- MMP基因在mRNA和蛋白水平均较癌旁组织阳性率高，而且表达主要在实质细胞胞浆，分布于癌巢周边，呈片状或灶状分布，肿瘤侵袭前缘其MMPs阳性表达率明显高于瘤实质核心，而癌旁阳性表达主要在间质细胞，而且表达阳性率低，表明MMP-2，MMP-9及MT-MMP基因激活是人胃癌癌变过程中的重要因素，且在癌变过程中始终存在. 在癌旁组织中的阳性表达有强与弱差异，亦表示MMPs亦可能属于一种正常生理状态下有持续弱阳性表达的存在，癌变中细胞的平衡系统失调，使瘤细胞具备了大量MMPs的能力降解细胞外基质，使其恶性浸润生长.

　　由于肿瘤细胞的异质性，并非所有的肿瘤细胞都具有转移潜能，故本研究中发现部分肿瘤组织并不表达基质金属酶，而有表达的瘤细胞也是呈散在、片状或灶状分布，而且多位于癌巢边缘或管腔近旁，这提示具有转移潜能的瘤细胞多位于肿瘤结节的表面及周边，因而也符合肿瘤细胞侵袭并脱落向远处转移的规律，观察到的少部分聚集成团块状并深度显色的癌细胞则可能为高转移的癌细胞克隆增殖所致. 本实验用石蜡切片免疫组化与冰冻切片原位杂交技术检测胃癌组织MMP-2和MT-MMP基因表达情况，两法结果显示有显著的一致性. 表明MMPs表达在mRNA及蛋白水平是相对稳定的，临床上可用免疫组化简便、快速、实用的进行诊断，为在鉴别胃癌的生物学行为标志物上提供了一种更有效的手段. 李楠，男，1957-11-18生，山东省青岛市人，汉族. 1983年青岛大学医学院五年制毕业，医学博士，主治医师，发表论文21篇，参编医学专著3部.

　　通讯作者　李楠，100037，海军总医院消化科，北京市阜成路6号.

　　Correspondence to: Dr. LI Nan, Department of gastroenterology, Chinese PLA Navy General Hospital, 6 Fuchenglu, Beijing 100037, China

　　Tel. +86*10*68570207(H)

　　收稿日期　1997-07-10　修回日期　1997-12-10

　　4　参考文献

　　1　Mattodosm LM. The matrix metalloproteinase. Bio Essays, 1992;14(4):455-463

　　2　蔡文琴，王伯泫，主编. 免疫组织化学和核酸分子杂交技术. 第1版. 北京：人民卫生出版社，1993：486-478

　　3　Sato J, Takino T, Okada Y. A matrix metalloproteinase expressed on the surface of invasive tumor cells. Nature, 1995;370(11):61-65

　　4　Hee J, Sook B, Hoy D. Anti-invasive activity of uroslie acid correlated with the reduced expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in HT-1080 human fibroscarecoma cells. Cancer Res, 1996;56(10):2281-2285

　　5　Gilles C, Polette M, Piette J. High level of MT-MMP expression is associated with invasiveness of cerviacal cancer cells. Int J Cancer, 1996;65(2):209-213