胃癌组织P16，P53蛋白和增殖细胞核抗原的表达意义

世界华人消化杂志 1999年第3期第0卷 研究原著

作者：赵　怡¹　张学庸¹　史宪杰²　胡沛臻³　张传山³　马福成³

单位：第四军医大学西京医院　¹消化内科　²普外科　³病理科陕西省西安市　710033

关键词：胃肿瘤；P16蛋白；P53蛋白；增殖细胞核抗原；免疫组织化学

　　中国图书资料分类号　R735.2

　　摘　要

　　目的　探讨P16，P53蛋白和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)在胃癌的发生、发展中的作用及临床意义.

　　方法　应用免疫组织化学方法，对77例胃癌和癌旁粘膜组织、21例胃正常组织中P16，P53蛋白表达产物和PCNA进行检测，并结合临床资料进行分析.

　　结果　胃癌组织中P16蛋白的阳性率为20.8%(16/77)，明显低于癌旁粘膜组织59.7%(46/77)和胃正常组织90.5%(19/21, P＜0.05)；P53蛋白与PCNA在胃癌组织中的阳性率为80.5%(62/77)和92.2%(71/77)，明显高于癌旁粘膜组织41.6%(32/77)，64.9%(50/77)和胃正常组织0.0%(0/21, P＜0.05). P16，P53蛋白和PCNA阳性表达与胃癌组织学类型、浸润深度、分化程度及淋巴结转移有显著性差异(P＜0.05)，与患者年龄、性别、肿瘤大小及部位无关(P＞0.01).

　　结论　P16，P53蛋白和PCNA的异常表达对胃癌的发生发展、恶性程度、淋巴结转移及预后有密切关系和重要临床意义.

　　Clinical significance of expressions of P16, P53 proteins and PCNA in gastric cancer

　　ZHAO Yi¹, ZHANG Xue-Yong¹, SHI Xian-Jie², HU Pei-Zhen³, ZHANG Chuan-Shan³ and MA Fu-Cheng³

　　Department of ¹Gastroenterology and²General Surgery and ³Pathology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Shanxi Province, China

　　Subject headings　stomach neoplasms; P16 protein; P53 protein; proliferating cell nuclear antigen; immunohistochemistry

　　Abstract

　　METHODS　P16, P53 proteins and PCNA expressions were detected in 77 specimens of gastric carcinoma and pericarcinoma tissues, as well as 21 samples of normal gastric tissue by the method of immunohistochemistry. The data were analyzed in connection with clinical findings.

　　RESULTS　The positive rate of P16 protein expression was 20.8% (16/77) in gastric carcinoma samples and was significantly lower than that in both pericarcinoma tissues (59.7%, 46/77) and normal gastric tissues (90.5%,19/21, P＜0.05). The positive rates of P53 protein and PCNA expression were 80.5% (62/77) and 92.2% (71/77) in gastric carcinoma samples and they were significantly higher than those in pericarcinoma tissues (41.6%，64.9%) and normal gastric tissues (0.0%, P＜0.05). The positive expressions of the P16, P53 proteins and PCNA were correlated with histological typing, degree of differentiation, depth of invasion and lymph node metastasis of gastric carcinoma (P＜0.01), and were not correlated with age, sex, tumor size and sites (P＞0.01).

　　CONCLUSION　The abnormal expressions of P16, P53 proteins and PCNA are closely correlated to the occurrence and development, malignancy degree, lymph node metastasis and prognosis of gastric carcinoma. The detection of P16, P53 profein and PCNA implies important clinical significance for gastric carcinoma treatment.

　　0　引言

　　在肿瘤发生发展中，抑癌基因的失活和癌基因的激活起着十分重要的作用. 胃癌的发生是一个涉及多种癌相关基因协同作用的结果. 作为一个新的抑癌基因p16基因已受到越来越广泛的重视. p53基因结构和表达异常是人类肿瘤中最常见的基因改变之一. 增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表达与细胞的增殖状态密切相关. 我们应用免疫组化技术检测了P16， P53蛋白和PCNA在胃癌(gastric carcinoma)中的表达，旨在探讨三者与胃癌发生发展、恶性程度、淋巴结转移及预后的关系，并结合临床有关资料进行分析，现报告如下.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　胃癌组织77例(男48例，女29例，平均年龄55.8岁)及正常胃组织21例均来自本校西京医院病理科手术及活检标本，组织经100mL/L福尔马林固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片，分别进行免疫组化和HE染色诊断确实. 鼠抗p16mAb购自美国Santa Cruz公司，鼠抗p53 mAb(DO-7克隆系)、鼠抗PCNA mAb(PC10克隆系)及Dako En Vision^TM System两步法免疫组织化学染色试剂盒购自丹麦Dako公司.

　　1.2　方法　石蜡切片常规脱蜡至水，30mL/L H₂O₂ 甲醇封闭内源性过氧化物酶活性，室温下10min，PBS振洗5min×3，浸泡于10mmol/L柠檬酸缓冲液中(pH 6.0)，微波修复抗原10min，自然冷却至室温后蒸馏水洗涤，PBS振洗5min×3，正常山羊血清封闭非特异背景染色37℃ 30min，切片加鼠抗p16 mAb(1∶200)，鼠抗p53 mAb(1∶100)，鼠抗PCNA (1∶200). 4℃过夜，37℃复温30min，PBS振洗5min×3，切片加mouse En Vision^TM 37℃ 30min， PBS振洗5min×3，DAB显色，镜下终止. 苏木精衬染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，树脂封片观察. 阳性对照：用P16，P53和PCNA阳性的切片重复染色；阴性对照：用PBS代替第一抗体；替代对照：用正常鼠血清代替第一抗体.

　　2　结果

　　P16蛋白免疫组化阳性信号为棕黄色颗粒，定位于胞质内. P53蛋白阳性染色呈弥漫点状大小不一的细颗粒状，核仁不着色，呈粗大的棕黄色颗粒状，定位于细胞核. PCNA阳性表达定位于细胞核内，呈颗粒状或弥散散在. P16，P53蛋白和PCNA在胃癌、癌旁组织及正常胃组织中的表达见表1. 77例胃癌组织P16，P53蛋白和PCNA表达与胃癌患者年龄、性别、肿瘤大小及部位，经统计学处理后，未见明显差异(P＞0.05). P16，P53蛋白和PCNA阳性表达与胃癌分化程度、组织学类型、浸润深度及淋巴结转移有显著性差异见表2.

表1　胃癌及癌旁组织中P16，P53和PCNA的表达

　　^aP＜0.05，vs 胃癌组织.

表2　胃癌组织P16，P53蛋白和PCNA阳性表达与病理参数的关系

　　^aP＜0.05，vs 高分化腺癌；^cP＜0.05，vs 有浸润，有转移.3　讨论

　　随着近年来肿瘤分子生物学的飞速发展，国内外的研究表明，抑癌基因的失活或突变与癌基因激活可导致肿瘤细胞的恶性转化和增殖. 本研究也发现，胃癌的发生是多种癌相关基因协同作用的结果. 抑癌基因p16可与细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)结合调节细胞周期，干扰细胞周期素D与CDK4结合，阻止细胞从G₁期进入S期. 抑癌基因p16是正常细胞周期的调控者，当p16基因缺失或突变而不能正常表达时，细胞则失去控制发生癌变^［1］. 本实验中，胃癌组织中P16蛋白的阳性率明显低于癌旁粘膜组织和胃正常组织(P＜0.05)，且P16蛋白阳性表达与胃癌分化程度、组织学类型、浸润深度及淋巴结转移有显著性差异，高分化腺癌中p16的阳性率(61.1%)高于低、未分化癌(P＜0.05)，在有浆膜侵犯和淋巴结转移的患者中P16阳性率低于未浸浆膜和无淋巴结转移(P＜0.05)，说明P16表达缺失与胃癌的发生发展、恶性程度和转移等进展有关.

图1　P16在胃癌中的阳性表达　400×

　　p53基因可分为野生型和突变型，前者为抑癌基因，后者为致癌基因. 由于野生型P53蛋白T_1/2短，导致其含量低，不易检出，而突变型P53蛋白稳定性强，T_1/2延长，可用免疫组化方法检出. 突变型P53蛋白失去了抗癌活性，它与DNA亲和力下降，抑制细胞的能力减弱^［2］. PCNA是一种M_r 36000的核蛋白，能与DNA多聚酶σ结合，与DNA复制有关，检测PCNA可客观反映细胞增殖特性，它的表达合成与细胞的增殖状态密切相关^［3，4］. 有关PCNA免疫组化在肿瘤诊断和研究的应用很多，认为PCNA对肿瘤的分级和预后有意义^［5］. 本研究表明，p53基因和PCNA在胃癌组织中的阳性率分别为80.5%(62/77)， 92.2%(71/77)，明显高于癌旁粘膜组织41.6%(32/77)，64.9%(50/77)和胃正常组织0.0(0/21，P＜0.05)；且在高分化腺癌中P53和PCNA的表达则低于粘液和未分化癌(P＜0.05)；在有浆膜侵犯和淋巴结的转移中，P53和PCNA高于未浸浆膜和无淋巴结转移(P＜0.05)，说明P53蛋白和PCNA阳性表达与胃癌组织学类型、浸润深度、分化程度及淋巴结转移有显著性差异(P＜0.05)，而Joypaul et al^［6］学者认为p53基因表达与胃癌淋巴结转移关系密切，与癌肿浸润深度无关，与本实验略有不同，有待进一步研究.

图2　P53在胃癌中的阳性表达　400×

图3　PCNA在胃癌中的阳性表达　400×

　　肿瘤的发生是以多种癌基因协同作用的结果. 本实验以P16,P53蛋白和PCNA检测77例胃癌和癌旁组织及21例胃正常组织，说明胃癌的发生发展是一个涉及多种癌基因的激活，抑癌基因失活的过程. 结合临床病例随访资料显示，胃癌患者中p16基因低表达，p53基因和PCNA高表达的低分化或未分化腺癌，术中局部浸润较深，常有淋巴结反应性肿大和转移，术后5a生存率均较低. 因此，检测P16，P53蛋白和PCNA的异常表达对胃癌的发生发展、恶性程度、淋巴结转移及预后有密切关系和重要临床意义.

　　作者简介：

　　赵怡，女，1966-06-01生，陕西省西安市人，汉族. 1989年第四军医大学军医系本科毕业，现为第四军医大学西京医院消化内科博士研究生，导师：张学庸教授. 主要从事消化内分泌疾病的研究工作.

　　通讯作者　赵怡，710033，第四军医大学西京医院消化内科，陕西省西安市.

　　Correspondence to:ZHAO Yi, Department of Gastroenterology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Shanxi Province, China

　　Tel. +86·29·3235125 Ext. 75310

　　Email. shixj @ fmmu. edu. cn

　　4　参考文献

　　［1］　Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993;366:704-707

　　［2］ Kem SE, Kinzler KW, Bakers SJ, Nigro JM, Rotter V, Levine AJ. Mutant P53 proteins bind DNA abnormally in vitro. Oncogene, 1991;6:131-136

　　［3］ Kruki, Lotz M, Ogata K, Tan TM. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA/cyc-lin) in activated human T lymphocytes. J Immunol, 1987;138:4114-4120

　　［4］ 史宪杰，李开宗，窦科峰，刘刚，张传山，王文亮. 增殖细胞核抗原在肝硬化、肝细胞不典型增生和肝细胞癌中的表达及意义. 中华实验外科杂志，1998；15：412-413

　　［5］　Al-Sheneber IF, Shibata HR, Sampalis J, Jothy S. Prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen expression in colorectal cancer. Cancer, 1993;71:1954-1959

　　［6］ Joypaul BV, Hopwood D, Newnan FL, Qureshi S, Grant A, Ogston SA. The prognostic significance of the accumulation of P53 tumor suppressor gene protein in gastric adenocarcinoma. Br J Cancer, 1994;69:943-946

收稿日期　1998-11-09