原位杂交方法检测胃癌及其癌前病变中抑癌基因p53的表达

世界华人消化杂志 1999年第6期第7卷 研究原著

作者：秦历杰

单位：河南省人民医院急诊科　河南省郑州市　450003

关键词：胃肿瘤；癌前状态；p53基因；基因表达；原位杂交

　　摘　要

　　目的　用原位杂交方法检测胃粘膜癌前病变及胃癌组织中 p53 mRNA的表达，并观察感染 Hp对其表达的影响.

　　方法　病理证实为慢性胃炎66例和胃癌16例，用地高辛标记的cDNA为探针进行原位杂交实验，检测其胃粘膜组织中p53 mRNA 表达，用单克隆抗体DO01进行免疫组化检测P53蛋白的表达.

　　结果　在慢性萎缩性胃炎、肠化生、异型增生及胃癌中，原位杂交方法检测p53 mRNA 表达率分别为53.9%，52.3%，42.8%和25%，免疫组化方法检测P53蛋白的表达率分别为0.0%，5.3%，15.4%和25%. p53 mRNA的表达与蛋白的表达无明显的一致性，p53 mRNA的表达可以在P53蛋白阴性及阳性的细胞中. 在26例萎缩性胃炎中，14例检测到p53 mRNA的表达，而其中16例(包括14例阳性病例)无一例检测到P53蛋白的表达. 在肠化生、异型增生及胃癌组织中也发现有类似的情况. Hp感染组与未感染组，p53 mRNA表达率之间统计学检验P＜0.05.

　　结论　在胃癌及其癌前病变中，随着病变的发展，p53 mRNA的表达率随之下降，Hp对其表达有明显的影响.

　　中国图书馆分类号　R753.2

In situ hybridization of P53 tumor suppressor gene in human gastric precancerous lesions and gastric cancer

QIN Li-Jie

　　Department of Emergency, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450003, Henan Province, China

　　Subject headings　stomach neoplasms; precancerous conditions; P53 gene; gene expression; in situ hybridization

　　Abstract

　　AIM　To study p53 expression, a tumor suppressor gene, in gastric precancerous lesions and gastric cancer and the influence of H.pylori.

　　METHODS　Sixty-six patients with histopathologically proven chronic gastritis and 16 patients with gastric cancer were studied. Dig-labeled cDNA probes, were used. p53 mRNA for in situ hybridization and immunohistochemical analysis was performed using monoclonal antibody D01.

　　RESULTS　For chronic atrophic gastritis, intestinal mataplasia dysplasia and gastric cancer, the expression rates of p53 mRNA were 53.9%，152.3%，42.8% and 25% with in situ hybridization, and the expression rates of P53 pro-oncogene were 0.0%，5.3%，15.4%and 25% using immunohistochemical staining. There was no obvious relationship between expression of p53 mRNA and protein. The cells with accumulation of p53 mRNA included both p53-positive and p53-negative immunoreactive cells. In 26 cases of chronic atrophic gastritis, 14 cases were positive for p53 mRNA, 16 had no significant accumulation of p53 immunohistochemical signal (including the 14positive cases). Similar conditions were observed in chronic atrophic gastritis, intestinal metaplasia, dysplasia and gastric cancer. Between H.Pylori positive and negative groups, the expression rates of p53 mRNA were significantly different statistically (P＜0.05).

　　CONCLUSION　In chronic atrophic gastritis, intestinal metaplasia, dysplasia and gastric cancer, the p53 mRNA expressions were decreased and H. pylori has a marked effect on its expression.

　　0　引言

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　入选患者共82例(近期未用抗菌素者)，经内镜及病理证实为慢性胃炎伴萎缩者26例，伴有肠化生者26例，慢性胃炎伴异型增生者14例，胃癌者16例. 每例在胃窦部取活检组织两块，立即用40mL/L的多聚甲醛固定6h～8h，或OCT包埋后置于液氮中保存，进行病理组织学检查、原位杂交及免疫组化实验，并取血2mL保留血清Hp抗体的检测.

　　1.2　方法

　　1.2.1　原位杂交方法　非放射性地高辛标记cDNA为探针进行原位杂交实验. 实验所用玻璃器皿均经180℃烘烤8h，以消除RNA酶，实验用水为DEPC处理的三蒸水. ①探针制作：随机引物法，地高辛标记的p53 (2.0kb)探针. ②探针标记：20μL反应体积中依次加入以下成分. 1.0μg(4μL)探针，2μL henanudeotide mixture，2μLdNTP，1μLKlenow enzyme，11μL灭菌三蒸水. ③探针沉淀：以上体系37℃20h后加入2μL EDTA(0.2mol/L，pH 8.0)终止反应，另入. 2.5μL4mol/L LiCl₄，75μL冰乙醇置于-20℃过夜. ④探针纯化：12000r/min离心30min，去上清，加入800mL/L冰乙醇洗，12000r/min离心10min，去上清，干燥后溶于50TE(pH 8.0)中，置于-20℃备用. ⑤杂交过程；组织切片常规二甲苯脱蜡，系列酒精复水(冰冻切片直接入DEPC水)，入10g/LDEPC水. 0.2mol/L HCl室温20min. 预热的2×SSC 70℃ 15min. 10mg/L PK(溶于0.1mol/L pH 7.4的PBS中)37℃ 30min PBS洗2×2min. 预冷的40g/L多聚甲醛4℃5min. PBS洗2次，每次2min. 预杂交. 37℃ 1h，2×SSC洗2次，每次2min，梯度脱水，500mL/L，800mL/L，905mL/L，1L/L乙醇各3min，空气干燥10min～20min，. 探针95℃ 5min后置于冰上5min，按探针浓度1mg/L～10mg/L用杂交液配制杂交液. 43℃过夜. 2×SSC室温20min，1×SSC室温20min，0.5×SSC 43℃ 20min，0.5×SSC室温20min. Washing buffer 5min. 1∶20正常羊血清(Blocking buffer稀释)封闭，室温20min，1∶5000的抗地高辛抗体(Blocking buffer稀释)37℃ 1h，Washing buffer 2×15min，Substrate buffer 5min. 显色. 0.45μL NBT，0.35μL BICP用Substrate buffer稀释到100μL，配制显色液. 于室温显色1h～3h. 镜检. 待信号出现时终止显色. 脱水，封片.

　　1.2.2　免疫组化方法　免疫组化链霉素-生物素过氧化酶(S-P)染色法. 组织切片常规脱蜡复水，过氧化氢封闭，胰蛋白酶消化，正常羊血清室温孵育. 1∶150稀释的-抗4℃过夜. 生物素化二抗1∶200室温30min. S-P复合物1∶200室温20min. 0.5g/L DAB-H₂O₂显色，随时镜检，充分冲洗后脱水.复染封片. 以细胞核染为棕色为检测信号^［4］.

　　1.2.3　ELISA方法　Hp1×10⁷包被96孔板，4℃过夜，BSA封闭. 待测血清1∶100稀释，每孔100μL，37℃1.5h. 1∶100稀释的酶标羊抗人IgG，37℃1.5h. 室温显色1min～10min. 以上各步之间用含0.5g/LTween的PBS洗3次，每次5min. 4mol/L H₂SO₄终止显色. 492nm处测光密度A(OD)值. 每次实验设立阴性及阳性对照. 以实验孔A/阴性孔A2为抗体阳性. 特异性86%，敏感性97%.

　　统计学处理χ²检验以P＜0.05为有统计学差异.

　　2　结果

　　原位杂交检测不同胃粘膜病变中p53 mRNA表达，结果见表1. 胃癌及癌前病变中Hp感染与p53 mRNA表达见表2. 免疫组化检测不同胃粘膜病变中P53蛋白表达，结果见表3. 胃粘膜p53原位杂交结果见图1.

图1　p53原位杂交结果A：萎缩性胃炎　B：肠化生　C：异型增生　D：胃癌

表1　不同胃粘膜病变中p53mRNA表达及与Hp感染的关系

表2　胃癌及癌前病变中Hp感染与p53mRNA表达

　　3　讨论

　　用原位杂交方法检测p53 mRNA的表达罕见报道，1992年，Sasano et al^［7］用原位杂交方法检测到正常食管粘膜内有p53 mRNA表达，而在食管癌的粘膜中则未检测到p53mRNA的表达. 对于正常胃粘膜内的p53 mRNA表达情况我们未作这一方面的研究，对胃癌及其癌前病变的胃粘膜标本检测结果显示，p53 mRNA信号呈蓝紫色颗粒散布于病变细胞的胞质中，在由萎缩-肠化生-异型增生-胃癌的过程中，p53 mRNA的表达是呈一下降的趋势，分别为53.8%，42.3%，42.8%，25%，表明随着病变的加重，p53 mRNA表达下降. p53基因的主要功能是对细胞的增殖起负调节作用，并对DNA的损伤修复起重要作用，p53含量的最高峰是在G1晚期及S早期，可能所检测到的p53 mRNA大多是在这一阶段的. 我们对其中部分标本进行了免疫组化实验，结果表明，P53蛋白的表达与p53 mRNA的表达无明显的一致性，p53 mRNA的表达可以在P53蛋白阴性及阳性的细胞中，在26例萎缩性胃炎中14例检测到p53的表达，而对其中16例(包括14例阳性的标本)进行免疫组化实验，则无一例检测出P53蛋白的表达. 在肠化生、异型增生及胃癌的病例中也存在同样的情况，因此我们考虑，p53 mRNA的表达与P53蛋白的表达之间无明显的联系，p53 mRNA的过表达并不导致其蛋白的表达. 可能是原位杂交所检测到的是野生型的p53 mRNA，而免疫组化的检测到的是突变后的P53蛋白.

　　在本研究中P53蛋白检出率16例萎缩性胃炎中无一例检测到p53表达. 在19例肠化生中1例，13例异型增生中2例，16例胃癌中4例检测到P53蛋白. 在由萎缩性胃炎-肠化生-异型增生-胃癌的发展过程中，其检出率呈一升高的趋势，分别为0.0%，5.3%，15.4%，25%，表明在这一过程中，p53突变率是逐渐升高的. 在Hp感染者中p53的检出率为8.3%(5/60)，而未感染者p53检出率为10.7%(3/28)，由于检出率少. 而未进行统计学处理. 原位杂交的结果显示在Hp感染者中，表达率为50.8%，未感染者中表达率为24%，统计学检验无显著性的差异. Shiao et al^［8］对胃癌及胃癌癌前病变的标本进行P53蛋白的检测表明，60%的不典型增生和60%的胃癌可以检测到p53的表达，用PCR方法测得在肠化生、异型增生及胃癌中，分别有37.5%，58.3%及66.7%检测到p53基因的变异，因而得出结论，认为p53变异是胃癌发生的早期事件. Hurliamn^［1］的结果表明在肠型胃癌中，34例有24例检测到p53的表达，其结果明显高于本研究的结果，这可能与不同的种族不同的地区胃癌的生物学行为不同有关. 我们的结果认为，p53变异在胃癌的发生过程中是较晚的事件，Hp对其影响不大. 目前尚不能得出结论Hp对p53的变异有影响. 而且本实验还存在样本数的问题. 由于我们所用的探针为野生型mRNA，理论上应和野生型的mRNA杂交而出现杂交信号，但一定程度上，它是否能和突变型的mRNA结合，还不是非常清楚，所以要明确Hp对p53变异的影响，还需要进一步的研究. 如PCR及测序等.作者简介：秦历杰，男，1960-01-15生，河南省郑州市人，汉族. 1996年河南医科大学消化系硕士毕业，主治医师，主要从事消化系统疾病的诊治研究，发表论文3篇，副主编《临床胰腺病学》.

　　通讯作者　秦历杰，450003，郑州市纬五路7号，河南省人民医院急诊科.

　　Correspondence to:Dr.QIN Li-Jie. Department of Emergency, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450003,Henan Province, China

　　Tel. +86·371·5951553 Ext.121

　　4　参考文献

　　1　Hurlimann J. 　Saraga EP Expression of P53 protein in gastric carcinomas. Association with histologic type and prognosis. Am J Surg Pathol, 1994；18：1247-1253

　　2 Dayioff AM, HumpHery PA, Iglehart JD, Marks JR. 　Genetic basis for p53 overpression in human breast cancer. Proc Natl Acad Sci USA, 1991;88:5006-5010

　　3 Iggo R, Gatter K, Barket J, Lane D, Harris AL. 　Increased expression of mutant forms of p53 oncogene in primary lung cancer. Lancet, 1990;335:675-679

　　4 Reich NC, Levine AJ. 　Growth regulation of a cellular tumor antigen, p53, in nontransformed cells. Nature, 1984;308:199-201

　　5 Rogel A, Popliker M, Webb CG, Dren M. 　p53 cellular tumor antigen analysis of mRNA levels in normal adult tissues enbryos and tumors. Mol Cell Biol, 1985;5:2851-2855

　　6 Takahashi T, Nau MM, Chiba I. 　p53: a frequent target for genetic abnormalities in lung cancer. Science, 1989;246:491-494

　　7 Sasano H, Guokon Y, Nishihira T Nagura H. 　In situ hybridization and immunohistochemistry of p53 tumor suppressor gene in human esopHageal carcinoma. Am J Pathol, 1992;141:545-550

　　8 Shiao YH, Rugge M, Correa P, Lehman P, Scheer WD. 　p53 alteration in gastric precancerous lesions. Am J Pathol, 1994;144:511-517

收稿日期　1998-12-21　修回日期　1999-03-21