转染Bcl-2反义核酸对胃癌细胞药物敏感性的影响

世界华人消化杂志 1999年第9期第7卷 研究快报

作者：王佐佑　肖冰　时永全　赵燕秋　樊代明

单位：王佐佑　中国人民解放军海军313医院内二科　辽宁省葫芦岛市　125000；肖冰　时永全　赵燕秋　樊代明　中国人民解放军第四军医大学消化疾病研究所　陕西省西安市　710033

关键词：胃肿瘤/ 药物疗法；寡核苷酸类，反义；Bcl-2原癌基因

　　中国图书馆分类号　R 735.2

　　Subject headings　stomach neoplasms/ drug therapy; oligonucleotides, antisense; Bcl-2 protooncogene

　　以手术根治为主的胃癌综合治疗，五年生存率只有37.7%，对胃癌的化疗并未取得理想的效果^［1］. Bcl-2基因的异常表达，不仅与胃癌的发生有关，其抗凋亡作用的发挥，势必影响化疗效果^［2］；肿瘤细胞对化疗药物存在多药耐药现象，缘于多种机制，Bcl-2基因的异常表达可能与之有关^［3］. 我们通过pDOR载体将Bcl-2反义核酸转染胃癌细胞，观察转导细胞对化疗药物顺铂(DDP)、5-氟脲嘧啶(5-FU)、长春新碱(VCR)的敏感性调变，能否逆转耐药，为胃癌的治疗探索新的途径.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　人胃癌细胞SGC7901引自军科院，本所保存150 mL/ L小牛血清的PRM1640培养传代(37℃、饱和湿度、50 mL/ L 二氧化碳)；耐药细胞SGC/ VCR本所建系，0.1 mg/ L终浓度培养维持耐药. 转染Bcl-2反义核酸的胃癌细胞AntiBcl-27901，AntiBcl-2/ VCR由肖冰博士后提供，系利用限制性内切酶技术构建Bcl-2反义核酸真核表达载体，脂质体介导转染SGC7901，SGC/ VCR，经4 wk G₄₁₈筛选，克隆细胞扩增培养建系.

　　1.2　方法　取对数生长期的细胞，计数后接种96孔板，培养24 h，加药. 药物浓度按小、正常、大浓度设置，正常浓度mg/ L=(mg×体表面积)/ 体质量×100÷60，小浓度为正常浓度的1/ 10，大浓度则是其10倍，各组均设对照，100 mL/ L小牛血清的PRM1640培养72 h后，每孔加50 g/ L MTT 20 μL，继续培养4 h，弃上清，加DMSO 150 μL，待结晶完全溶解，测A490 nm (OD)值，计算抑瘤率.

　　2　结果

　　转导细胞AntiBcl-27901对3种药物的敏感性不同程度增高，药物抑瘤率提高(表1). DDP在小剂量时的药物敏感性增强最明显，抑瘤率是在SGC7901细胞的2倍，5-Fu则在正常剂量时的药物敏感性提高最显著. Anti Bcl-2/ VCR对VCR仍呈耐药，但对DDP，5-Fu的敏感性增强(表2).

表1　三种药物对AntiBcl-27901的抑瘤率(%)

　　*方差分析发现VCR三种剂量条件下各组OD值，无显著差异P₁=0.52(SGC7901)，P₂=0.207(AntiBcl-27901). dDP, 5FU组OD值方差分析P＜0.01.

表2　三种药物对AntiBcl-2/ VCR的抑瘤率(%)

　　注：两种细胞各自在不同药物三种剂量条件下的OD值，方差分析P值均＜0.01.3　讨论

　　多数化疗药物以及放射治疗均通过诱发细胞凋亡而发挥抗肿瘤活性，Bcl-2明确的抗凋亡作用，使肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性降低. Huang et al^［4］在多种细胞系上，通过转染Bcl-2基因发现，Bcl-2蛋白与腺病毒蛋白E1B19KD在抗凋亡作用方面相似. 在本实验中，转染Bcl-2反义核酸，使Bcl-2蛋白表达下调，细胞对顺铂、5-氟脲嘧啶的敏感性增强，这表明，细胞表达Bcl-2与化疗药物敏感性有关，SGC7901胃癌细胞表达Bcl-2能够降低化疗药物的毒性，联合应用Bcl-2反义核酸与某些细胞毒药物有可能提高化疗效果，减少药物剂量，减轻药物毒副作用. 在人类罹患的各类癌症中，超过半数表达高水平的Bcl-2蛋白^［3］，而至今，对凋亡发生的确切机制知之不多，对Bcl-2在癌组织中的过度表达以及Bcl-2抗凋亡机制尚不清楚，在这种情况下，利用Bcl-2反义核酸使Bcl-2蛋白表达下调促进癌细胞的凋亡，以达到治疗肿瘤的目的，不失为一种可行的选择.

　　肿瘤细胞存在多药耐药现象，肿瘤细胞过度表达Bcl-2也可能是多药耐药机制之一. 转染Bcl-2反义核酸的antiBcl-2/ VCR细胞并未逆转对长春新碱耐药，说明Bcl-2蛋白表达不是SGC7901细胞对VCR耐药的主要因素；但对DDP，5-FU敏感性增强. 以上资料提示，对初次化疗后再次化疗的患者，转染Bcl-2反义核酸，有可能提高化疗效果.

　　Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸，不用载体，既可达细胞内，使Bcl-2蛋白表达下调，Reed证实，二者存在量效关系^［5］. 但Bcl-2蛋白下调与化疗药物毒性间有无量效关系还不清楚. 不同组织起源、不同分化程度、不同Bcl-2蛋白表达水平的恶性肿瘤间可能存在差异. Harnois et al^［6］在体外培养的胆管癌细胞系上发现，用18个硷基的Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸，使Bcl-2蛋白下调50%，Beauvericin诱导的早期凋亡(4 h)增加3倍. Cotter et al^［7］发现，Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸可阻止因t(14，18)染色体易位的人淋巴瘤细胞，在免疫缺陷小鼠体内成瘤. Webb et al^［8］将Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸进行Ⅰ期临床试验，9例经2次化疗后复发的非何杰金淋巴瘤患者，1例完全缓解，后续化疗后，有6/ 8例部分缓解. 对于胃癌等实体瘤，如何保证Bcl-2反义脱氧寡聚核苷酸在体内有效发挥作用，有待于深入探讨.

　　通讯作者　王佐佑

　　4　参考文献

　　1　郑芝田主编. 胃肠病学. 第2版，北京：人民卫生出版社，1992：381

　　2　Lauwers GY, Scott GV, Hendricks J. Immunohistochemical evidence of aberrant Bcl-2 protein expression in gastric epithelial dysplasia. Cancer, 1994;13:2900-2904

　　3　Reed JC. Promise and problems of Bcl-2 antisense therapy. J Nat Can Inst, 1997;89:988-990

　　4　Huang D, Cory S, Strasser A. Bcl-2, Bcl-X1 and adenovirus protein E1B19KD are functionally equivalent in their ability to inhibit cell death. Oncogene, 1997;14:405-414

　　5　Reed JC, Stein C, Eubasinghe C, Haldar S, Croce CM, Yum S, Cohen J. Antisense-mediated inhibition of Bcl-2 protooncogene expression and leukemic cell growth and survival: comparions of phosphodiester and phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Cancer Res, 1990;50:6565-6570

　　6　Harnois DM, Que FG, Celli A, Larusso NF, Gores GJ. Bcl-2 is overexpression and alters the threshold for apoptosis in a cholangiocarcinoma cell line. Hepatology, 1997;26:884-890

　　7　Cotter FE, Johnson P, Hall P, Pocock C, Mahdi N, Cowell JK. Antisense oligonucleotides suppress B-cell lymphoma growth in a SCID hu mouse model. Oncogene, 1994;9:3049-3055

　　8　Webb A, Cunningham D, Cotter F, Clarke P, Stefano F, Ross P, Corbo M, Dziewanowska Z. Bcl-2 antisense therapy in patients with non-Hodgkin lymphoma. Lancet, 1997;349:1137-1141