应用基因转染方法调节HSP70在人胃癌细胞株SGC7901中的表达

世界华人消化杂志 1999年第9期第7卷 研究原著

作者：郭建成　李继昌　樊代明　乔泰东　张学庸

单位：郭建成　樊代明　乔泰东　张学庸　中国人民解放军第四军医大学西京医院全军消化疾病研究所　陕西省西安市　710033；李继昌　河南医科大学第一附属医院

关键词：热休克蛋白；胃肿瘤；转染

　　摘要　目的　为探讨HSP70在人胃癌中过度表达的意义，调节HSP70在人胃癌细胞系SGC7901中的表达.　方法　应用脂质体介导的基因转染方法，将表达针对HSP70的反义RNA表达载体及HSP70表达载体转入SGC7901细胞，通过hygromycine抗性筛选，挑选阳性克隆；对阳性克隆从RNA水平(点杂交及RNase保护试验)及蛋白质水平(Western blot及免疫组化)进行研究.　结果　HSP70在转染细胞中的表达得到了调节. 为进一步研究HSP70对胃癌形成与发展的作用创造了条件.　结论　经过HSP反义或正义RNA转染的SGC7901细胞具有不同的HSP70表达水平可用于胃癌发生机制的研究.

　　中国图书馆分类号　R 735.2

Regulation of HSP70 expression in human gastric cancer cell line SGC7901 by gene transfection

GUO Jian-Cheng¹, LI Ji-Chang², FAN Dai-Ming¹, QIAO Tai-Dong¹ and ZHANG Xue-Yong¹

　　¹Digestive Disease Institute of Chinese PLA, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China

　　²The 1st Teaching Hospital of Henan Medical University

　　Abstract　AIM　To regulate the expression of HSP70 in human gastric cancer cell line SGC7901 for clarifying the role of HSP70 in carcinogenesis of human gastric cancer.　METHODS　An antisense RNA to HSP70 expressing vector pBBS212/ as-hsp70 and a sense RNA to HSP70 expressing vector pBBS212/ HSP70 were constructed and transfected into human gastric cancer cell line SGC7901 via lipofectamine mediated transfection. The clones of transfected cells were selected with hygromycine. The expression of HSP70 in the transfected cells was evaluated at mRNA level (dot blotting and RNase protection assay) and protein level (Western blotting and immunohistochemical staining).　RESULTS　The expression of HSP70 was successfully regulated in different transfected cells, up-regulated in pBBS212/ hsp70 transfected group and down-regulated in pBBS212/ as-hsp70 transfected group.　CONCLUSION　The cells expressing different levels of HSP70 can be used for further studies concerning the role of HSP70 in carcinogenesis of human gastric cancer.

　　Subject headings　heat shock protein; stomach neoplasms; transfection

　　0　引言

　　HSP70是体内含量最多的分子伴侣^［1］，资料显示HSP70与一些肿瘤的产生与发展有关^［2-4］. 我们发现，HSP70在人胃癌组织中过度表达^［2］，为探讨HSP70对人胃癌产生与发展的作用，我们通过在人胃癌细胞系SGC7901细胞中转染针对HSP70的反义RNA表达载体pBBS212/ as_hsp70和HSP70表达载体pBBS212/ hsp70的方法调节了HSP70在胃癌细胞株SGC7901中的表达，作为进一步研究的基础.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　针对HSP70的反义RNA表达载体pBBS212/ as-hsp70和HSP70表达载体pBBS212/ hsp70的构建.

　　1.2　脂质体介导基因转染　将处于对数生长期的SGC7901细胞用胰酶消化后，加入6孔板中，每孔2 mL，含3×10⁵细胞，继续培养约12 h～16 h使达到80%融合. 用无抗生素的无血清RPMI1640培养液洗涤细胞，待转染、 在无菌条件下配制A液(100 μL无血清RPMI1640培养液+质粒DNA 2 μg)，B液(90 μL无血清RPMI1640培养液+10 μL lipofectamine). 将A，B两液混合，置室温下反应30min，使脂质体充分包裹质粒，之后加入不含血清及抗生素的RPMI1640至2 mL，轻轻混匀并滴加到洗过的细胞中. 37℃，50 mL/ L CO₂培养6 h后更换为含100 mL/ L FBS的RPMI1640液继续培养，48 h～72 h后进行Hygromy_cine抗性筛选.

　　1.3　Hygromycine抗性克隆的挑选及扩增　在显微镜下选出生长状态良好的hygromycine抗性克隆，并作好标记. 弃去培养基，以克隆环蘸取少许凡士林，分隔细胞克隆，向克隆环中滴加胰酶消化3min～5min，吸去消化液，以少许培养基吹吸克隆，然后转入24孔板内以含hygromycine的培养基培养，待孔底长满后，转入培养瓶扩增培养.

　　1.4　Hygromycine抗性克隆Hsp70表达的研究　1.4.1　RNA水平的研究　①斑点杂交：RNA变性、点样、预杂交及杂交、放射自显影. 取已定量的RNA样品，分别加入2倍体积的100%甲酰胺，0.7倍体积的370 g/ L甲醛，0.2倍体积的20×SSC，混匀后置68℃水浴15min，迅速置冰水中冷却，点样. 放于80℃烤箱烤2 h. 将点好RNA样品的膜用6×SSC浸湿放入塑料袋中，加预杂交液12 mL，封口后置于68℃中水浴2 h. 取出杂交袋，向预杂交液中加入探针，重新封口，在68℃中温育16 h～24 h. 取出杂交膜在不同浓度SSC溶液中反复漂洗，取出NC膜，放射自显影. ②RNase protection assay:细胞RNA 10 μg，加³²P 1.0×10⁵min^-1标记的单链寡核苷酸探针；无水乙醇、glycogen 25 μg(终浓度25 mg/ L沉淀体积)、1/ 10体积3 mol乙酸钠，-20℃放置20min；离心沉淀；800 mL/ L乙醇洗涤；加30 μL甲酰胺杂交buffer重悬；85℃ 10min，迅速置37℃，过夜；加RNase S buffer及RNase S 2 U(Promega公司)，37℃消化60min；乙醇沉淀；加20 μL100 g/ L SDS，2.5 μL 20 g/ L蛋白酶K，37℃ 15min；酚/氯仿抽提；乙醇沉淀(加1 μL 10 g/ L yeast tRNA,1 mL沉淀体积)；真空干燥；重溶于5 μL～10 μL RNA上样缓冲液［800 mL/ L formamide, 1 mmol/ L EDTA pH 8.0，1 g/ L bromphenol blue, 1 g/ L xylene cyanol］；配制电泳凝胶；采用18%变性聚丙烯酰胺凝胶(可根据探针长度调整丙烯酰胺浓度)；电泳，1 xTBE电泳缓冲液；8 V/ cm，120min；放射自显影.

　　1.4.2　蛋白质水平的研究　①免疫印迹(Western blotting)：三去污法制备细胞总蛋白样品. SDS-PAGE电泳及电转移. 免疫学检测. 简要如下：取含相同含量的蛋白的样品，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，沸水中煮5min，然后点于凝胶上样孔，同时设标准分子量蛋白对照. 电泳. 在4℃下以60 V恒压转移约8 h，将蛋白转移至NC膜上. 加封闭液15 mL/ L BSA，配制于洗涤液)，于37℃作用1.5 h后，弃之. PBS洗膜3×10min. 加入鼠抗人Hsp70 mAb(Stress Gen公司，1∶4 000稀释)，于37℃孵育1 h后，弃之. PBS洗膜3×10min. 加入HRP标记的马抗鼠IgG(Vector公司，1∶800稀释)，37℃温育1 h，弃之. PBS洗膜3×10min. 加入含DAB的底物溶液，显色，拍照. ②免疫组织化学染色：细胞爬片经3 mL/ L过氧化氢封闭内源性过氧化物酶30min，1 mL/ L马血清孵育40min后加抗HSP70(1∶3000)，4℃过夜. 次日加马抗鼠生物素化二抗(1∶100)，37℃，30min；ABC复合物，37℃，30min. 之后用DAB显色. 以上各步骤除血清孵育后甩干血清直接加一抗外，均间以PBS三遍洗涤. 阴性对照以PBS代替一抗，阳性对照为已知HSP70阳性的人脑组织标本.

　　2　结果

　　2.1　RNA水平研究　点杂交显示，应用针对HSP70反义mRNA的探针进行杂交时，从转染pBBS212/ as-hsp70的细胞中提取的RNA出现杂交信号，其他细胞无杂交信号(图1a).

　　而应用针对正义HSP70 mRNA的探针进行杂交时，各组细胞中的RNA均出现杂交信号，其中转染pBBS212/ s-hsp70的细胞中的RNA的杂交信号增强，而转染pBBS212/ as-hsp70的细胞中杂交信号降低(图1b).

图1a　应用针对热休克蛋白反义RNA ³²P标记的探针在不同细胞RNA斑点印渍：泳道1，SGC7901细胞；泳道2，经pBBS212/ as-hsp70转染的SGC7901细胞；泳道3，经pBBS212/ hsp70的SGC7901细胞；仅转染了pBBS212/ as-hsp70细胞RNA出现杂交信号.

1b　应用针对热休克蛋白正义RNA ³²P标记的探针在不同细胞RNA斑点印渍：泳道1，SGC7901细胞；泳道2，经pBBS212/ as-hsp70转染的SGC 7901细胞；泳道3，经pBBS212/ hsp70的SGC7901细胞，泳道4,对VCR耐药的SGC 7901细胞；仅转染了pBBS212/ hsp70的和对VCR耐药的SGC7901细胞的RNA杂交信号增强.

　　RNA Protection Assay显示，应用针对HSP70反义RNA的探针与细胞RNA杂交后，转染了pBBS212/ as-hsp70的细胞出现了阳性信号，而其他细胞则无(图2a)；应用针对HSP70 mRNA的探针与细胞RNA杂交后，转染pBBS212/ hsp70的细胞中的RNA的杂交信号增强(图2b).

图2a　核糖核酸酶保护试验. 应用针对HSP70反义RNA^32P标记的探针检测经过不同基因转染的SGC7901细胞的热休克蛋白70反义RNA表达情况：β-肌动蛋白作为内对照. 泳道3及泳道4为转染了pBBS212/as-hsp70基因的SGC7901细胞，均有条带显示；而泳道1(SGC7901细胞)及泳道2(转染了pBBS212/hsp70基因的SGC7901细胞)无条带显示.

2b　核糖核酸酶保护试验. 应用^32P标记的针对HSP70 RNA的探针检测经过不同基因转染的SGC7901细胞热休克蛋白70 RNA表达情况. β-肌动蛋白作为内对照. 泳道1，经pBBS212/as-hsp70基因的SGC7901细胞；泳道2及泳道3，经pBBs212/ hsp70基因的SGC7901细胞；泳道4，未经处理的SGC7901细胞. 显示泳道2及泳道3有增强的杂交信号.

　　结果提示，转染针对HSP70反义RNA表达载体的细胞中表达了反义RNA，转染HSP70表达载体的细胞中HSP70 mRNA表达增高.

　　2.2　蛋白质水平研究　Western Blot显示，转染pBBS212/ hsp70的SGC7901细胞组阳性条带增粗、增强；转染了pBBS212/ as-hsp70细胞组阳性条带内信号变细、减弱(图3).

图3　蛋白质印渍检测，示不同细胞的HSP70表达情况. 经pBBS212/hsp70转染的SGC7901细胞HSP70的表达上调，而经pBBS212/ ashsp70转染的SGC7901细胞HSP70的表达下调. HSP90 β亦染出示等量蛋白质载入.

　　免疫组化显示，Hsp70在胞内染成棕黄色细颗粒状，与Western blotting结果相对应，转染pBBS212/ hsp70的SGC7901细胞内Hsp70染色增强；转染pBBS212/ as-hsp70的细胞内Hsp70染色减弱(图4)

图4　免疫组化染色显示不同细胞中HSP70的表达情况. ①经 pBBS212/ hsp70转染的SGC7901细胞；②经pBBS212/ as-hsp70转染的SGC7901细胞；③SGC7901细胞. 与③相比，HSP70的表达在①增强，在②减弱.

　　结果提示，HSP70在转染pBBS212/ hsp70的细胞中呈高表达，而在转染pBBS212/ as-hsp70细胞中呈低表达.

　　3　讨论

　　HSP70在人类肿瘤特别是胃癌中过度表达，其生物学意义尚不完全清楚. Jaattela^［6］应用基因转移方法，在WEHIS细胞中过度表达HSP70，可使细胞获得对TNF-α及单核细胞杀伤的耐受，从而认为，HSP70在肿瘤细胞中的过度表达有助于肿瘤细胞免疫逃逸. Kiji et al^［7］通过转基因技术在SHOK细胞中过度表达HSP70，发现高表达HSP70的细胞生长增速，基因稳定性下降. Wei et al^［8］应用槲皮酮及反义HSP70多聚寡核苷酸抑制HSP70基因表达，可使细胞生长受抑，发生凋亡.

　　我们应用脂质体介导基因转染方法成功地在人胃癌细胞系SGC7901中转染了HSP70的反义RNA的表达载体及HSP70的正义RNA表达载体，通过对细胞RNA及蛋白质水平的研究表明，HSP70在转染细胞中的表达得到了调节，转染pBBS212/hsp70的细胞中HSP70表达增加；而转染pBBS212/as-hsp70的细胞中HSP70表达减少. 为进一步研究HSP70在人胃癌中的表达的生物学意义创造了条件.

　　通讯作者　张学庸，710033，陕西省西安市长乐西路17号，第四军医大学西京医院全军消化疾病研究所.

　　作者简介：建成，男，1963-12-01生，河南省新安市人，汉族. 1986年中山医科大学毕业，1997年第四军医大学医学博士，发表论文8篇.

　　Correspondence to:ZHANG Xue-Yong，Digestive Disease Institute of Chinese PLA, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, 17 Changle Xi Road, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China

　　Tel.+86·29·3374576　　Fax.+86·29·2539041

　　Email.xyzhang@fmmu.edu.cn

　　4　参考文献

　　1　Norimoto RI, Tissieres A, Coergopoulos C The stress response, function of the proteins, and prospectives. In: Morimoto RI. Heat shock protein and molecule chaperones. eds. Cold Spring Harbor NY: CPHI Press, 1994

　　2　Guo JC, Yang YS, Fan DM, Zhang XY. Over-expression of heat shock protein in human gastric cancer. Aizheng,(to be published)

　　3 Koshiyama M, Konishi I, Mandai M. Immunohistocheical analysis of p53 protein and 72 kDa heat shock protein expression in ovarian carcinoma in correlation with clinicopathalogy and sex steroid receptor status. Virchow Archiv, 1995;425:603-609

　　4 Gandour Edwards R, Kapadia PS, Janecha IP, Biologic markers of invasive pituitary adenomas involving the sphcnoid sinus. Mod Pathol, 1995;8:160

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　　8 Wei YQ, Zhao X, Kariya Y. Inhibition of proliferation and induction of apoptosis by abrogation of heat shock protein 70 expression in tumor cells. Cancer Immun. Immunother, 1995;40:73-78

收稿日期　1999-03-06　修回日期　1999-03-30