顺铂杀伤原代胃癌细胞的体内外实验研究

中国胃肠外科杂志 2000年第4期第3卷 论　著

作者：张俊　朱正纲　刘风华　刘炳亚　纪玉宝　尹浩然　林言箴

单位：上海第二医科大学附属瑞金医院外科上海消化外科研究所 200025

　　关键词： 胃肿瘤；顺铂；化疗

　　【摘要】目的评价顺铂对原代胃癌细胞的体内外杀伤效应。方法采用纯化后的人体新鲜胃癌细胞，用台盼蓝染色法和四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测经顺铂作用后细胞活力及代谢活性的变化；另用末端脱氧核苷酸转移酶法(TdT法)和正常免疫小鼠肾包膜下种植法(SRC法)分别检测顺铂体外促凋亡效应及体内抑瘤率。结果经顺铂作用后，肿瘤细胞出现明显的形态学改变和代谢活性的下降；不同个体肿瘤细胞对顺铂敏感性不同，低分化胃癌细胞较高分化者更敏感（40.25％比34.26％）；10倍血药浓度下顺铂对肿瘤细胞的抑制率高于单倍浓度（40.10％比38.45％）。经顺铂作用后，原代胃癌细胞凋亡率增加，为32.12％。顺铂还能明显抑制体内移植瘤的生长。结论顺铂可能通过包括诱导凋亡在内的多种途径杀伤原代胃癌细胞，尤对低分化者显示了明显的肿瘤杀伤效应。

Antitumor effect of cisplatin in vivo and in vitro on fresh human gastric cancer

ZHANG Jun, ZHU Zhenggang , LIU Fenghua , et al.

　　Department of Surgery, Shanghai Institute of Digestive Surgery, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025,China

　　【 Abstract】 Objective To evaluate the antitumor effect of cisplatin in vivo and in vitro on fresh human gastric cancer cells. Methods Highly purified gastric cancer cells were obtained from 50 resected primary lesions for the MTT assay and trypan blue exclusive assay. The degree of apoptosis induced by cisplatin was determined by terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT) assay in 20 cases. Simultaneously, the inhibitory effect of CDDP in vivo was investigated by subrenal capsule ossay(SRC)assay in 24 cases . Results Remarked morphologic and metabolic changes , which varied from one patient to another,were found in gastric cancer cells after exposure to cisplatin. Poorly differentiated gastric cancers were more sensitive to cisplatin than well differentiated ones (40.25％ vs 34.26％ ). The inhibition rate increased with the elevation of drug concentration. The average apoptic rate induced by CDDP was 32.12％ in fresh human gastric cancer cells. The obvious inhibitory effect of CDDP in vivo was also showed by SRC assay. Conclusions A complex mechanism may be used to explain the antitumor effect of CDDP, which might be a good candidate in chemotherapy for poorly differentiated gastric cancers.

　　【 Key words】 Gastric neoplasm； Cisplatin； Chemotherapy

　　顺铂属金属络合物类抗肿瘤药物,近年来在胃癌化疗中的作用日益被重视^[1]。研究顺铂体外抑癌效应多以细胞株为对象^[2]。我们采用纯化后的人体新鲜胃癌细胞，分别用台盼蓝染色法、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测顺铂对肿瘤细胞活力和代谢活性的影响；另用末端脱氧核苷酸转移酶法(TdT法)和正常免疫小鼠肾包膜下种植法（SRC法）分别检测顺铂促凋亡能力及体内抑瘤率，以综合评价顺铂对原代胃癌细胞的体内外杀伤效应。

　　材料与方法

　　一、原代胃癌细胞的分离与纯化

　　50例新鲜胃癌标本均取自手术切除之原发灶，经病理证实且术前未行化、放疗。用胶原酶、透明质酸酶和DNA酶消化后，经不连续密度梯度离心及洗涤，分离出高纯度的细胞，调整浓度至1×10⁶/ml^[3]。

　　二、台盼蓝染色法及MTT法检测

　　将细胞均匀接种至96孔平底培养板，分别加入终浓度为血浆峰浓度（4μg/ml）及10倍血浆峰浓度的顺铂，于37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养48h后，用台盼蓝染色法在倒置显微镜下观察细胞形态，并用MTT法检测肿瘤细胞代谢活性的变化并计算其抑制率。抑制率大于50％为高度敏感；30％～50％为中度敏感；抑制率小于30％为低度敏感^[4]。

　　三、TdT标记法

　　20例经血浆峰浓度顺铂作用24h后的肿瘤细胞离心，含1％甲醛的PBS液固定后，与0.5μg末端转移酶，0.5nM生物素标记的dUTP(bio-16-dUTP)在37℃下孵育，加入抗生物素蛋白标记的异硫氰酸荧光素(FITC)，避光30min后沉渣涂片。光镜下随机计数200个肿瘤细胞，再在荧光显微镜下计数这些视野下荧光阳性细胞的数量，后者与前者之比即为荧光阳性细胞的百分率^[5]。用药组荧光阳性细胞百分率减去对照组荧光阳性细胞百分率即为用药组肿瘤细胞的凋亡率。

　　四、SRC法^[6]

　　另24例新鲜胃癌组织在冰浴下切成直径约2mm，万分之一电子天平上称重(2.5±0.1)mg。6～8周龄的清洁级BALB/C小鼠麻醉后，经肋下暴露肾脏，将瘤块注入近肾下级的凸面肾包膜下，复位肾脏后缝合切口。术后5d每d皮下注射2mg/kg的顺铂，同时设不注药的对照组。术后第6d处死动物再测肿瘤重量，将对照组瘤块移植末重量/瘤块移植初重量大于或等于1作为可评价试验的指标。用R值大小判定顺铂的体内抗肿瘤效果。即R=用药组肿瘤消退率总和减去对照组肿瘤消退率总和。R大于或等于100为敏感；R小于100为不敏感。

　　五、统计学方法

　　组间比较采用t检验。

　　结果

　　一、顺铂作用后原代胃癌细胞的形态学改变

　　倒置显微镜下，可见新鲜分离的胃癌细胞，形态大小不等，核质丰富，核浆比增大，并可见核分裂相（图1）。药物作用48h后，经台盼蓝染色，可见细胞数量明显减少，细胞活力下降，渐渐失去贴壁性，胞浆内空泡增加，形态完整性受破坏，形成大量细胞碎片（图2）。

图1　纯化后的人体胃癌细胞(×200)

图2　顺铂治疗后的人体胃癌细胞(×200)

　　二、顺铂对原代胃癌细胞的体外抑制率

　　MTT法结果提示，顺铂对50例不同个体胃癌细胞的抑制率各不相同。10倍峰浓度下的抑制率高于单倍峰浓度，呈现浓度依赖性现象。虽然浓度的大幅增加并未相应地引起抑制率的同步上升（40．10％比38．45％），但就高敏例数而言，10倍峰浓度下为10例，占20％，而单倍峰浓度下仅为4例，占8％，两者之间差异有显著性（P＜0．05）。在单倍峰浓度下，顺铂对低分化胃癌的平均抑制率为(40．25±9．56)％，对高分化者为(34．26±6．59)％，两者之间差异有显著性（P＜0．05）。

　　三、顺铂对原代胃癌细胞的促凋亡率

　　经末端转移酶及FITC标记，可在荧光显微镜下观察到凋亡细胞，其荧光浓聚区多以细胞核为主，一些细胞核内染色均匀一致。未加药物的对照组亦可见荧光阳性的细胞，为自发性凋亡。顺铂诱导不同个体胃癌细胞的凋亡率不尽相同，在单倍血药浓度下，顺铂诱导原代胃癌细胞凋亡的平均凋亡率在(32．12±10．68)％。

　　四、顺铂对体内移植瘤的抑制率

　　人体胃癌组织瘤块移植于小鼠肾包膜下后呈结节性生长，隆起于肾表面，与正常肾组织分界清楚。平均1周后瘤块停止生长或逐渐缩小。经顺铂作用后的体内移植瘤与对照组相比，生长明显缓慢。所测24例标本中，9例对顺铂敏感，15例不敏感，平均R值为126．34。其中13例低分化腺癌的平均R值为148．20，而11例高分化者为108．75，前者高于后者，但两者间差异无显著性意义。

　　讨论

　　本研究结果显示，顺铂在体内外对原代胃癌细胞均发挥了明显的杀伤效应。经顺铂作用后，光镜下可观察到明显的肿瘤细胞数量减少及细胞碎裂、坏死等形态学变化。MTT法也检测到其细胞内脱氢酶活性下降，细胞代谢和增殖受抑制。单倍血浆峰浓度下，顺铂对原代胃癌细胞的平均抑制率为38．45％，提示胃癌属对顺铂中等敏感的恶性肿瘤。而不同个体胃癌细胞对顺铂的敏感性也不尽相同，由此可见胃癌细胞的异质性。这一结果与顺铂单药用于进展期胃癌化疗的临床缓解率大致相当^[7]。

　　顺铂是铂的金属络合物，其主要靶点为DNA，与DNA形成Pt－GG和Pt－AG链内交联体，此外还通过链间交联使DNA损伤，破坏其复制而发挥细胞毒作用^[7]。在高剂量时，顺铂的抗癌作用类似于烷化剂，将氯解离后，二价铂与DNA链上碱基形成交叉连接，抑制DNA的生物合成，杀灭细胞周期中各期细胞。本研究还提示，顺铂对原代胃癌细胞的抑制率呈现明显的浓度依赖现象。10倍血药浓度下对原代胃癌细胞的平均抑制率高于单倍血药浓度。但浓度的大幅增加并未引起体外抑制率的相应上升，提示临床使用中应选择合适的药物浓度，一味增加剂量并不能得到相应的肿瘤杀伤效果，反而增加并发症的发生率。

　　体外MTT法及体内SRC法均显示，分化较低的胃癌细胞比分化高者对顺铂有更高的敏感性，体外法所测两者之间差异显著。

　　近来研究表明，包括顺铂在内的多种化疗药物发挥细胞毒作用的共同机制是最终引致细胞凋亡，是由多种原癌基因和抑癌基因共同参与的复杂过程^[8-10]。我们用TdT法也检测到经顺铂作用后，原代胃癌细胞凋亡率的上升，且顺铂诱导低分化胃癌细胞的凋亡率高于高分化者。

　　本实验结果提示，顺铂可通过包括凋亡在内的多种途径杀伤肿瘤细胞。在体外能破坏细胞活力、影响细胞代谢并促进凋亡；而且能抑制体内移植瘤的生长，尤其对低分化胃癌细胞显示了较强的杀伤效应。

　　基金项目：上海市医学发展基金资助项目(983008)

　　参 考 文 献

　　1.Preusser P, Achterrath W, Wilke H, et al. Chemotherapy of gastric cancer.Cancer Treat Rev， 1988,15:257-277.

　　2.Kim R, Ohi Y, Inoue H, et al. Activation and the interaction of proapoptotic genes in modulating sensitivity to anticancer drugs in gastric cancer cells. Int J Oncol, 1999， 15:751-756.

　　3.Yamane H,Tanimura T, Noguchi K,et al.Chemosensitivity testing of fresh gastric cancer with highly purified tumor cells using the MTT assay. Br J Cancer, 1992， 66 :794-799.

　　4.Remmelink M, Salmon I, Delville JP, et al. In vitro characterisation of soft tissue tumor chemosensitivity. Anticancer Res, 1997,17 :2009-2017.

　　5.Gorczyca W, Gong J, Darzynkiewicz Z ,et al. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation asssays. Cancer Res, 1993， 53:1945-1951.

　　6.Ognino M, Sakamoto T. Subrenal capsule assay as a test to predict the effectiveness of chemotherapy in choriocarcinoma. Gynecol Oncol, 1990， 38:32-40.

　　7.Schipper DL, Wagener DJ. Chemotherapy of gastric cancer. Anticancer Drugs,1996， 7:137-149.

　　8.Saris CP, Van de Vaart PJ, Rietbroek RC, et al. In vitro formation of DNA adducts by cisplatin, lobaplatin and oxaliplatin in calf thymus DNA in solution and in cultured human cells. Carcinogenesis,1996， 17:2763-2769.

　　9.Berry MA, Behnke CA, Eastman A. Activation of programmed cell death (apoptosis) by cisplatin; other anticancer drugs, toxins and hyperthermia. Biochem Pharmacol, 1990,40:2353-2362.

　　10.Lowe SW, Bodie S, McClatchey A, et al. P53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo. Science,1994,266:807-810.

(收稿日期：2000-09-04)