残胃粘膜屏障损伤与残胃癌前病变关系的实验研究

中国普外基础与临床杂志 1999年第1期第9卷 基本与实验研究

作者：汤礼军　田伏洲　麻晓林　周丁华　晏才杰

单位：汤礼军　田伏洲　成都军区总医院全军腹部外科中心(成都　610083)；麻晓林　周丁华　晏才杰　第三军医大学新桥医院普通外科

关键词：残胃粘膜；癌前病变；跨胃粘膜电位差；脱氧核糖核酸；犬

　　摘要　为研究胃大部切除术后残胃粘膜屏障损伤与残胃粘膜癌前病变的关系，在甲基硝基亚硝基胍(N-methy-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)诱发犬残胃粘膜癌前病变过程中，胃镜下定期行残胃粘膜活检的同时，对跨胃粘膜电位差(gastric transmucosal potential difference, GTPD)及粘膜细胞核DNA含量进行了动态测定。结果：随着残胃吻合口粘膜病变加重，GTPD值呈渐进性下降趋势，且GTPD值与相应粘膜细胞核DNA含量之间呈显著负相关关系。本实验结果提示：随着残胃粘膜屏障损伤程度的加重，粘膜组织细胞恶变潜能就越大；残胃粘膜屏障损伤在残胃癌前病变发生过程中起着至关重要的作用。

EXPERIMENTAL STUDY ON THE RELATION BETWEEN THE DAMAGE OF GASTRIC REMNANT MUCOSAL BARRIER AND THE PRECANCEROUS LESION OF GASTRIC REMNANT MUCOSA AFTER SUBTOTAL GASTRECTOMY

Tang Lijun, Tian Fuzhou, Ma Xiaolin, et al. Centre of Abdominal Surgery, Chengdu Army General Hospital, Chengdu 610083

　　Abstract　To find the relation between the damage of gastric remnant mucosal barrier and the precancerous lesion of gastric remnant mucosa, in the process of the canine gastric remnant precarcinogenesis induced by N-methy-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), we performed regularly the esophagogastroscopy and the mucosal biopsy.At the same time, we also measured gastric transmucosal potential difference and intracellular DNA content of remnant mucosa.We found that the more severe the damage of gastric remnant mucosal barrier was , the greater the malignant capacity of gastric remnant mucosal was.Our study suggests that the damage of gastric remnant mucosal barrier plays an important role in the gastric remnant mucosal precarcinogenesis.

　　Key words　　Gastric remnant mucosa　　Precancerous lesion　　Gastric transmucosal potential difference　　Deoxyribonucleic acid　　Dog

　　胃大部切除术后残胃粘膜癌变一直是人们所关注的问题。目前在残胃粘膜癌变机理研究领域尚存在着一些不明确或有争议的问题。据此，本研究在建立犬残胃粘膜癌前病变模型的基础上，应用纤维胃镜对残胃粘膜屏障的损伤情况进行了动态观察，并结合粘膜细胞核DNA含量测定结果，着重探讨了残胃粘膜屏障损伤与残胃癌前病变之间的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物与分组

　　选用本地健康雄性杂种犬19只，犬龄1～3岁，体重11.3±1.52kg。随机编号分组：1～12号为手术组，13～19号为对照组。

　　1.2　动物模型的制备

　　手术组犬施行Billroth Ⅱ式胃大部切除术，对照组犬仅行单纯开腹术。自术后1个月始，所有实验犬均喂以饱和氯化钠溶液的干饲料。每3天取甲基硝基亚硝基胍(N-methy-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)2g用蒸馏水配制成2g/L的保存液，避光冷藏。每天配制200μg/ml稀释液150ml，供犬自由饮用，共12个月。

　　1.3　胃粘膜活检及跨胃粘膜电位差测定

　　1.3.1　胃粘膜活检两组犬均于手术前及术后第2、4、6、8、10及12个月定期进行胃镜下粘膜活检。活检部位限于胃窦或吻合口及胃体中部的大、小弯和前、后壁。若肉眼发现明显病变者，也属取材之列。

　　1.3.2跨胃粘膜电位差(GTPD)测定　参考Takeuchi等^〔1〕方法自制测量电极。测量时，参比电极固定于犬腹部皮肤，探测电极经胃镜活检孔插入胃内，端部轻触于被测粘膜约数秒钟，待毫伏表数字稳定后，即读取并记录数据。测量部位限于胃窦或吻合口及胃体中部的大、小弯和前、后壁。每处取3个邻近的位点，取其均值。每部位的GTPD值＝（前壁+后壁+大弯+小弯)/4。

　　1.4　组织学检查及有效标本数

　　1.4.1　组织学检查活检标本用10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察其病理学改变。病理诊断及分级参照全国胃癌研究协作组病理组制定的标准^〔2〕。

　　1.4.2有效标本数　依据病理学诊断结果，将每只手术组犬每次活检的吻合口粘膜标本中病变最重者计作本研究的有效标本。据此，共获各种有效标本数：浅表性胃炎13，萎缩性胃炎16，肠化生14，异型增生27(轻度9，中度8，重度10)。此外，另取来源于术中手术切缘且经组织学诊断为正常胃粘膜的9例标本计入本实验的有效标本之列。

　　1.5　细胞核DNA含量测定

　　取备用的石蜡块作厚度为4μm的切片，行常规Feulgen染色。应用MD20型真彩图像分析仪，在统一放大倍数下(物镜×63，150W氙灯)将染色后的切片输入系统。每张切片随机选择分散、完整及无重叠的单个细胞核100个，测得其积分光密度作为DNA含量值。

　　1.6　统计学处理

　　计数资料阳性百分率比较用χ²检验，计量资料以±s表示，应用医学统计学程序“PDA-2”文件对各组数据进行单因素方差分析。以P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有极显著性差异。

　　2　结果

　　2.1　胃粘膜活检结果

　　本实验中手术组犬死亡3只，对照组犬无死亡。实验末期(术后第12个月)两组犬胃粘膜癌前病变发生情况见表1。手术组犬吻合口粘膜的萎缩性胃炎、肠上皮化生及异型增生发生率明显高于对照组犬胃窦或胃体部粘膜(P＜0.05，P＜0.01)。

表1　术后12个月时各组犬胃粘膜癌前病变发生率(%)

与对照组犬胃体或胃窦比较，*P＜0.05；**P＜0.01

　　2.2　细胞核DNA含量及GTPD值

　　不同时相两组犬胃粘膜细胞核DNA含量及GTPD值测定结果见表2、3。随着诱发时间的延长，手术组犬吻合口粘膜细胞核DNA含量呈明显递增趋势，而在残胃体及对照组犬胃窦或胃体部变化则不明显。正常生理状态下，胃窦、胃体等部位因粘膜离子流通状态不同，而产生不同的GTPD。本实验中，随着诱发时间的延长，手术组犬吻合口及对照组犬胃窦部的GTPD呈逐渐递减趋势。吻合口部的GTPD值于术后第2个月开始，以后各时相均明显低于术前。胃窦部则自术后第6个月才有此种变化。

表2　各时相两组犬胃粘膜细胞核DNA含量(Au，±s)

手术组犬术前DNA含量值测自术中手术切缘粘膜标本

表3　各时相两组犬GTPD值(mV,±s)

吻合口组内与术前比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；胃窦部组内与术前比较，*P＜0.05，**P＜0.01；手术组犬术前GTPD值测自术中手术切缘粘膜

　　2.3　胃粘膜病变与GTPD及DNA含量的关系

　　胃粘膜病变与GTPD间的关系见表4。随着胃粘膜病变加重，GTPD呈渐进性下降趋势。浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生及异型增生各组GTPD值均明显低于正常胃粘膜组(P＜0.05，P＜0.01)。萎缩性胃炎和肠化生两组的GTPD值无显著性差异，但明显低于浅表性胃炎组而高于异型增生组(P＜0.05)。重度异型增生组GTPD值明显低于前面任何一组(P＜0.01)。

表4　手术组犬吻合口粘膜各病变阶段GTPD值

病理改变	例数	GTPD值(mV)
			s
正常胃粘膜	9	35.50	1.18
浅表性胃炎	13	33.91△	1.76
萎缩性胃炎	16	30.85△△	0.84
肠上皮化生	14	30.80△△	0.96
异型增生	27	28.22△△	2.50
轻度	9	29.27	1.18
中度	8	29.21	1.19
重度	10	25.89*	2.23

与正常胃粘膜比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与前任何一组比较，*P＜0.01

　　GTPD与DNA含量的关系见附图。本研究将分别于术前、术后第2、4、6、8、10及12个月所测得的手术组犬吻合口粘膜GTPD值与相应的细胞核DNA含量作一相关分析。结果显示：两者间呈非常显著的负相关(r＝-0.92，P＜0.01)，回归方程为Y＝75.82-0.22X。

附图　GTPD与DNA含量间相关分析

　　3　讨论

　　正常胃粘膜表面有一由多种成分组成的自身保护性屏障。粘膜两侧的各种离子(H^＋、Na^＋、K^＋、Cl^-、HCO^-₃)维持一定的浓度梯度而形成电位差，又称跨胃粘膜电位差。研究表明，各种急、慢性损伤因素致使胃粘膜损伤时，GTPD下降，且与粘膜损伤程度平行。当损伤修复时，GTPD也敏感地升高^〔3〕。因此，GTPD可作为一反映胃粘膜屏障完整性准确而敏感的指标^〔4〕。

　　胃粘膜屏障损伤是一受多因素影响的复杂过程。正常胃粘膜有着强大的再生能力，且表面覆有一层粘液屏障。当胃粘膜受到如胆汁等物质刺激时，粘膜的损伤程度取决于侵袭损伤与再生修复之间的平衡。业已证实，胃粘膜屏障的损伤或削弱，在有致癌剂存在的情况下，与胃粘膜癌变的关系甚为密切，并随损伤程度加重，肿瘤的发生率也随之升高^〔5，6〕。胃大部切除术后，返流的碱性肠内容物无疑是造成残胃粘膜屏障损伤的直接因素^〔7〕。这种残胃粘膜屏障损伤与残胃癌前病变发生的关系如何，目前少见文献报道。

　　本实验对两组犬胃粘膜GTPD的动态测定结果发现，于术后第2、4、6、8、10及12个月，手术组犬吻合口GTPD值均明显低于手术前，且呈渐进性下降趋势，而对照组犬胃窦部于实验中期(第6个月始)才有类似上述的改变(可能由碱性MNNG长期滞留于胃窦部所致)。在整个实验过程中，残胃体或胃体部的GTPD值均无显著变化。可见，胃大部切除术后，胆汁等碱性物质返流可造成残胃粘膜屏障损伤，其损伤部位主要位于吻合口。本实验中，手术组犬吻合口粘膜癌前病变发生率最高。由此可推测，粘膜屏障的破坏与残胃粘膜癌前病变的发生可能存在着平行关系。吻合口粘膜癌前病变发生率之所以最高，可能与其粘膜屏障遭受最严重的破坏有关。

　　本实验发现，随着残胃粘膜病变加重，GTPD值呈渐进性下降趋势。浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生及异型增生各组GTPD值均明显低于正常粘膜组。萎缩性胃炎和肠化生两组的GTPD值无显著差异，但均显著低于浅表性胃炎组而高于异型增生组。重度异型增生组的GTPD值明显低于轻、中度者及其它各组值。此结果提示，在残胃粘膜各种癌前病变阶段，残胃粘膜屏障(或完整性)均遭到了不同程度的破坏，且随病变加重，损伤程度也呈逐渐加重趋势。重度异型增生阶段，粘膜的完整性已遭到严重破坏。萎缩性胃炎及肠化生两病变阶段的屏障功能损伤程度无显著性差异，可能是由于在一定的损伤限度及一定的时间范围内，粘膜的再生修复能力与损害因子侵袭所引起的损伤之间达到了一动态平衡状态。但在此状态下，残胃内致癌物质仍可持续不断地侵蚀腺体，病变仍可进一步发展。

　　细胞核DNA含量的增加是细胞增殖活性增强的客观反映，而增殖活性越强的细胞，恶变潜能越大^〔8，9〕。本实验结果中，粘膜细胞核DNA含量与相应的GTPD值间呈显著负相关关系，表明随着残胃粘膜屏障损伤程度的加重，粘膜细胞增殖活性越强或恶变潜在性越大。

　　综上实验结果我们推测，胃大部切除术后残胃粘膜屏障受到损伤或削弱时，可导致胃内致癌物质容易越过此屏障而直接作用于深层的腺体颈部干细胞，发挥其致癌作用。屏障功能损伤越严重，可为更多的致癌物质侵袭深层腺体提供机会，病变则有可能进一步向恶性方向发展。或者说，病变越重的残胃粘膜常伴有越严重的屏障功能损伤。反之，若损伤的粘膜屏障通过机体自身的再生与修复而恢复至正常或近乎正常状态时，残胃内的致癌物质不能再继续或仅有少部分侵入深层作用腺体而致癌，此时，即使已有病变的腺体(或粘膜)有可能向正常方向逆转或维持原状而不继续恶化。临床上，患者年龄越大，术后残胃癌变发生的可能性也越大^〔10〕，可能与年长者机体对粘膜屏障损伤的自身再生与修复能力下降有关。因此，粘膜屏障功能损伤可能是残胃粘膜癌前病变的一个重要发病条件。加强对术后残胃粘膜的保护及增加其抗损害能力，对预防残胃粘膜癌变有着重要的意义。

　　参　考　文　献

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　　2　全国胃癌防治研究协作组病理组. 胃及十二指肠粘膜活检病理. 第1版. 沈阳：辽宁人民出版社， 1991∶134～135

　　3　Morris CP, Hoei L, Yelson K, et al. Correlation between changes in indicators of gastric mucosal barrier integrity at time of exposure to “barrier breaker” and extent of hemorrhagic erosions one hour later. Dig Dis Sci, 1984; 29(1)∶6

　　4　Goddard PJ, Lenard DM. In vitro recovery of canine gastric mucosal surface hydrophobicity and potential difference after aspirin damage. Dig Dis Sci, 1995; 40(6)∶1357

　　5　Sorbye H, Pieol HY, Scot LE, et al. Gastric carcinogenesis in rats given hypertonic salt at different times before a single dose of MNNG. J Cancer Res Clin Oncol, 1994; 120(120)∶159

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　　7　汤礼军，晏才杰，麻晓林等. MNNG诱发犬残胃粘膜癌前病变组织中MG7-Ag表达的动态定量研究. 胃肠病学和肝病学杂志， 1996； 5(1)∶32

　　8　Imai T, Moit L, Soue H,et al. Reduction of cell proliferative activities of gastric stump adenomatous hyperplasias after bile reflux diversion in rats. Carcinogenesis, 1993; 14(23)∶1765

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(1997-12-01收稿，1998-06-30修回)