食管癌多部位DNA含量分析及其临床意义

　　癌症1999年第18卷第1期

张冬成　陈秉燮　梅品超　龚光甫

　　摘　要　目的：探讨食管癌多部位DNA含量与临床及病理特性之间的关系。方法：流式细胞光度术检测100例食管癌手术切除新鲜标本的癌、癌旁和断端组织的DNA含量。结果：癌组织DNA非整倍体(AN)、DNA指数(DI)和细胞增殖活性指数(PI)都显著高于癌旁和断端(P＜0.05)；食管癌AN与肿瘤细胞分化和局部淋巴结转移密切相关(P＜0.01)。在癌体与癌旁或断端组织间存在DNA倍体异质性(14.8％)；切距＜5cm的断端组织AN和PI显著高于切距≥5cm组(P＜0.05)。结论：食管癌多部位流式细胞DNA含量的分析在揭示肿瘤恶性生物学行为、指导临床治疗和术后随访具有重要的意义。

　　关键词：食管肿瘤 流动血细胞计数 DNA含量 细胞周期 倍体异质性

　　本文报道应用流式细胞光度术(Flow Cytometry)同时分析食管癌癌体、癌旁和断端组织细胞DNA含量，试图从核酸代谢的分子水平揭示其恶性生物学行为，探讨在肿瘤浸润过程中是否存在DNA倍体异质性，以及评估肿瘤复发的危险性，从而给临床治疗和随访提供指导。

　　1　材料和方法

　　1.1材料

　　经病理诊断确诊的食管癌手术切除新鲜标本100例，每例分别在癌体、癌旁1cm处和上切缘各取组织3～5g，冰冻保存。所有病例均未行术前放射或化学治疗。

　　1.2方法

　　1.2.1单细胞悬液制备：新鲜标本用机械分散法结合酶辅助消化法处理。组织用PBS(pH7.2)洗净后剪成1mm³碎块，置于80目铜网上用小汤匙轻辗，边以PBS缓滴；收集滴下的液体后自然沉淀30分钟，吸取上层液保留。下层沉淀液加入0.5％胶原蛋白酶Ⅰ(含5μg/ml DNase)5ml，37℃消化15分钟，间断振荡。中止消化，离心1500prm×3分钟，去除酶液后，加入吸取的上层液，离心后再悬浮，100目尼龙网过滤，取少许在显微镜下观察证实已获得单细胞悬液，70％乙醇固定，4℃冰箱保存。

　　1.2.2DNA染色：采用碘化丙啶一步插入性DNA定量染色法^〔1〕。上机检测前将样品固定剂乙醇洗去，调整细胞数1×10⁵个/ml。每份样品加入鸡红细胞悬液15μl(作为DNA含量内参照标准)，混匀，加入染液1.0ml，避光4℃冰箱中染色30分钟后，300目尼龙网过滤，即可上机检测。

　　1.2.3DNA含量检测：流式细胞仪FACSort型(美国B－D公司产品)，波长488nm，氩离子激光器作激发光光源。每份样品检测10000～20000个细胞，由计算机分析DNA组方图和细胞周期各时相细胞比例，并打印结果。鸡血红细胞DNA含量峰道值为内参照标准，其DNA含量相当于正常人二倍体细胞DNA含量的37％^〔2〕。计算各类细胞的DNA指数(DNAIndex.DI=样品细胞Go/G₁期DNA含量的峰道值/正常细胞Go/G₁期DNA含量的峰道值)和细胞增殖活性指数(Proliferation Index,PI∶S期和G2M期细胞数占细胞总数的百分比)。

　　1.2.4统计学分析：应用SAS软件进行t检验、方差分析和χ²检验。

　　2　结果

　　100例食管癌共300份样品，经流式细胞仪检测成功92例共276份样品。

　　2.1各部位组细胞的DI值、倍体类型和PI值

　　表1显示，从断端、癌旁至癌，DI和非整倍体率都逐渐增高。癌组织DI值显著高于断端和癌旁组织(P＜0.001)，而癌旁组织和断端组织的DI值没有统计学差异(P＞0.05)。非整倍体率和PI值在断端、癌旁和癌的任意二组间都存在显著性差异(P＜0.05)。

表1　92例食管癌各部位组DNA检测结果

分组	例数	DI(±s)	DNA倍体类型		PI
			2C(％)	AN(％)
断端	92	1.06±0.22＃	78(84.8)	14(15.2)＊	14.8±7.7＊
癌旁	92	1.10±0.32＃	59(64.1)	33(35.9)＊	17.5±8.5＊
癌体	92	1.25±0.45＃＃	27(29.3)	65(70.7)＊	20.7±9.1＊

　　注：2C：二倍体；AN：非整倍体＃＃与＃相比，P＜0.001；＊P＜0.05

　　2.2DNA非整倍体组方图分型

　　可表现为多克隆、典型和小克隆等亚型。癌组织非整倍体组方图较多地表现为多克隆或典型非整倍体峰(图1)，而癌旁和断端组织则较多表现为小克隆非整倍体峰(图2)。

图1　癌细胞DNA多克隆非整倍体组方图，亚二倍体和超二倍体并存

图2　癌旁组织DNA小克隆非整倍体组方图。在正常G0/G₁峰和G₂M峰之间出现一个较低平的非整倍体峰

　　2.3癌体与无癌部位之间的倍体异质性

　　27例食管癌二倍体肿瘤中，有4例(4/27，14.8％)其癌旁或断端组织倍体为非整倍体，与癌体倍体不一致，表现为倍体异质性。

　　2.4食管癌DNA倍体与临床及病理特性的关系

　　表2显示，食管癌DNA非整倍体与肿瘤组织学分化及局部淋巴结转移密切相关(P＜0.01)，而与肿瘤部位、长度、浸润管壁深度、临床分期、病程及病人性别等因素无关(P＞0.05)。

表2　DNA倍体与临床及病理整性的关系

＊按1987年UICC食管癌TNM分期标准＃和＃＃表示有统计学差异(P＜0.01)；其它P＞0.05

　　2.5断端组织DNA倍体与切距的关系

　　表3显示，切距＜5cm组的DNA非整倍体率及PI都显著高于≥5cm组(P＜0.01和P＜0.05)。

表3　切距与DNA倍体和PI的关系

＊P＜0.01；＊＊P＜0.05

　　3　讨论

　　近年来，国内外许多学者应用流式细胞仪对多种消化系肿瘤的研究发现，肿瘤细胞的DNA含量和临床分期、细胞分化以及预后均有密切的关系^〔3～5〕。但对食管癌术后新鲜标本作多部位的DNA含量分析，目前尚未见报道。

　　从本组材料，食管癌DNAAN率为70.7％，明显高于癌旁和断端组织。从断端、癌旁至癌，DI逐级增高，且癌体的AN峰较多表现为多克隆亚型，显示出旺盛的增殖状态。细胞周期的分析，PI显示与DI一致；DI和PI均具有同向趋势。PI的增高意味着肿瘤细胞增殖活跃，具有更强的浸润性。而对DNA倍体与食管癌临床及病理特性的关系分析显示，DNAAN与肿瘤细胞组织学分化和局部淋巴结转移密切相关，而与临床分期、病程、肿瘤浸润深度、肿瘤部位与长度等临床参数无关，证明DNAAN是一个反映肿瘤恶性程度高的内在指标，有助于恶性肿瘤的诊断。在食管癌病例中，淋巴结转移阳性者预后比阴性者差得多。食管癌淋巴结转移阴性者的五年生存率达53.8％，显著高于淋巴结转移阳性者的15.3％^〔6〕。

　　随着恶性肿瘤DNA倍体研究的不断深入，人们发现，在肿瘤内不同部位存在着不同细胞亚群倍体不相一致的现象，据此近几年来许多学者提出了DNA倍体异质性(DNA ploid heterogeneity)的概念^〔7，8〕。但在癌体与其它无癌部位间是否也存在DNA倍体异质性?本研究对食管癌标本多点取材检测DNA含量证实同样存在，倍体异质性率为14.8％。Nicolgon^〔9〕和Nowell^〔10〕指出，肿瘤倍体异质性的出现，就意味着浸润型和转移性更强的新的肿瘤细胞亚群的出现，因而就会产生对药物治疗的抵抗性。出现这种DNA倍体异质性现象的机理目前尚不明了，还有待于进一步的研究。

　　食管癌术后的局部复发是影响病人远期生存率的重要因素。文献中多将其原因仅归结于因手术切除长度不足所造成的断端癌细胞残留。本研究对每例标本的断端组织进行DNA含量检测，发现断端＜5cm组AN率和PI都显著高于≥5cm组。这表明切距越短，受主体癌的影响，其断端出现AN的机率和细胞的增殖活性越高。但不容忽视的是在断端≥5cm组中也有7.8％的病例出现AN。断端出现AN和PI增高是术后复发的高危因素。表明食管癌术后复发不仅与手术切距有关，断端DNA非整倍体和PI增高也是重要因素。因此，了解断端组织(特别是切距＜5cm者)DNA倍体和细胞增殖状况，对指导术后的综合治疗和随访监视具有重要的价值。本文尚缺少临床随访资料，对食管癌DNA含量与预后的关系还有待于进一步的研究。

　　作者单位：张冬成　陈秉燮（汕头大学医学院肿瘤医院胸外科(汕头，515031)）

　　梅品超（汕头大学医学院中心实验室(汕头，515031)）

　　龚光甫（湖南医科大学附属二院心胸外科(长沙，410011)）

　　参考文献

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　　[2]左连富主编.流式细胞术样品制备技术.北京华夏出版社，1991：21

　　[3]Ikeguchi M, Ohfuji S, Oka A, et al. Aneuploidy of tumor cells of gastric cancer with esophageal invasion: another indicater of poor prognosis. J Surg Oncol, 1995， 58(2)： 83

　　[4]Cottier M, Jouffre C, Maubon I, et al. Prospective flow cytometric DNA analysis of hepatocellular carcinoma specimens collected by ultrasund－ guided fine needle aspiration. Cancer, 1994， 74(2)： 599

　　[5]Armitage NC, Ballantyne KC, Evand DF, et al. The influence of tumor cell DNA content on survival in colorectal cancer: a detailed analysis. Br J Cancer, 1990， 62(3)： 852

　　[6]Akiyama H, Tsurumaru M, Kawamura T, et al. Principle of surgical treatment of the esophagus: Analysis of lymph node involvement. Ann Surg, 1987， 194(2)： 438

　　[7]Haraguchi Y, Baba M, Takao S, et al. Flow cytometric analysis of DNA heterogeneity in superficial carcinoma of the esophagus. Cancer, 1995， 75(4)： 914

　　[8]Caery FA, Lamb CC. Intratumoral heterogeneity or DNA content of lung cancer. Cancer, 1990， 65(9)： 2266

　　[9]Nicolson GI. Tumor cell instability, deversification, and progression. Cancer Res, 1987， 47(5)： 1473

　　[10]Nowell PC. Cytogenetics of tumor progression. Cancer, 1990， 65(9)： 2172