表皮生长因子及其受体在食管癌中的表达

解剖学报 1999年第1期第0卷 论著

作者：丁明杰　丁蔚　银德仁　白经修　张娓　高晓东　张林庆　牛富文　付士显

单位：丁明杰　丁蔚　白经修　张娓　高晓东　张林庆　牛富文　付士显(河南医科大学组织学胚胎学教研室，450052）；银德仁（新乡市中心医院病理科)

关键词：表皮生长因子(EGF)；表皮生长因子受体(EGFR)；食管癌；免疫组织化学

　　【摘要】　目的　研究表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)及其受体(EGF receptor, EGFR)在食管鳞状细胞癌中的表达。　方法用免疫组织化学ABC法分析并研究染色结果与病理改变之间的关系。EGF染色，以正常人颌下腺作为阳性对照。EGFR以正常人胎盘组织为阳性对照。EGF和EGFR染色一抗的浓度分别为1∶200，1∶100，4℃孵育48h。　结果　EGF强阳性18例，弱阳性16例，EGFR强阳性18例，弱阳性16例。EGF和EGFR的表达分为两种类型：M型：癌组织本身免疫组织化学反应强弱不同，D型：癌组织中免疫组织化学反应强度均一。D型与M型在EGF、EGFR的表达中较一致。M型较多发生淋巴结转移(P＜0.05)，并且强阳性组中M型所占比例较大。　结论　EGF及EGFR强阳性表达同食管癌病人的预后有关。

EXPRESSION OF EPIDERMAL GROWTH FACTOR AND

　　ITS RECEPTOR IN ESOPHAGEAL CANCER

Ding Mingjie，Ding Wei，Yin Deren^*，Bai Jingxiu，Zhang Wei，Gao Xiaodong，

　　Zhang Linqing，Niu Fuwen，Fu Shixian

　　(Department of Histology and Embryology, Henan Medical University, Zhengzhou,^*Department of Pathology, Xinxiang Central Hospital)

　　【Abstract】 Objective In order to detect the expression of both EGF and EGFR in human esophageal squamous cell carcinoma.Method The specimens from 34 patients with esophageal cancer were studied by immunohistochemical assay.Results The EGF and EGFR were faintly expressed in basal and parabasal layers of normal esophageal epithelia. No correlation was found between the intensity of EGF、EGFR staining and the histologic type, the patients with strongly expressed EGF and EGFR had lymph node metastases more frequently. The EGF and EGFR expression showed a mosaic (M) pattern in 15 patients and diffuse (D) pattern in 19 patients. The patients with a M pattern had lymph node metastases more frequently than those with a D pattern. In cancer cells, EGFR was stained both in the cytoplasm and on the cell membrane, some of them in the nucleus.Conclusion The overexpression of EGF and EGFR could be of prognostic significance in esophageal cancer.

　　【Key words】 Epidermal growth factor(EGF); Epidermal growth factor receptor (EGFR); Esophageal carcinoma; Immunohistochemistry

　　EGF是美国学者Cohen^［1］首先发现的。近年来发现，erb-B癌基因产物与EGF受体十分相似。已有报道，在肺癌，乳腺癌，胃癌，膀胱癌，脑瘤，胰腺癌等^［2］肿瘤组织中，含有EGF或EGF受体，并发现EGF受体同肿瘤病人的预后有关^［3］。EGF能刺激某些肿瘤细胞株的生长^［4，5］。可见，EGF在肿瘤的发生发展过程中起重要的作用。有关表皮生长因子同食管癌发生的关系方面，近来国外已有少数报道，且报道结果不一^［6］，国内尚未见报道。为进一步探讨表皮生长因子同食管癌发生、发展的关系。我们运用免疫组织化学方法，检测食管癌组织中EGF及EGF受体的表达情况，结果发现，34例食管癌病例中EGF和EGFR均有不同程度的表达，EGF强阳性组18例，EGFR强阳性组18例，EGF和EGFR的表达分为M型和D型，M型较多发生淋巴结转移(P＜0.05)。提示EGF及EGFR强阳性表达同病人的预后有关。

　　材料和方法

　　1.材料

　　1.1　食管癌标本：食管癌病人术前均未经化疗和放疗。取材部位为癌实质、癌旁组织、淋巴结及正常组织。取材后，标本经10%福尔马林固定，常规脱水，56℃石蜡包埋。每例标本连续切片，厚5μm。1张行HE染色做病理学检查，2张行免疫组织化学染色。共采集标本34例，均为食管鳞癌。

　　1.2　主要试剂：

　　1.2.1　羊抗人EGF多克隆抗体；鼠抗人EGF-R单克隆抗体；人的EGF纯品；均为美国UBI公司产品。

　　1.2.2　兔抗羊ABC试剂盒：马抗鼠ABC试剂盒；均为美国Vector公司产品。

　　2.方法

　　2.1　免疫组织化学染色过程：按常规ABC染色方法进行，一抗浓度分别为：抗EGF多克隆抗体1∶200；抗EGF-R单克隆抗体1∶100。标本置封闭湿盒中4℃冰箱孵育48h；然后滴加生物素化抗体37℃孵育30min；最后滴加ABC试剂，37℃孵育60min，显色后苏木素复染核，常规脱水封片。

　　2.2　对照实验：阳性对照：(1)EGF染色以人的颌下腺为阳性对照。(2)EGF受体染色以正常人胎盘组织为阳性对照。阴性对照：(1)空白对照：以PBS代替第一抗体。(2)阴性对照，以正常血清(EGF用兔血清，EGF受体用马血清)代替第一抗体。

　　3.病理分型

　　按食管癌国际分级标准将食管癌分为3级：高分化鳞癌(鳞癌Ⅰ级)，中分化鳞癌(鳞癌Ⅱ级)，低分化鳞癌(鳞癌Ⅲ级)。

　　4.结果判定

　　免疫组织化学结果，根据颜色将免疫反应强度分级如下：

　　(±)反应呈淡黄色，反应产物隐约可见。(+)反应明显，产物清晰可见，呈黄棕色。(++)反应较强，反应产物呈棕色。(+++)反应强，反应产物呈棕褐色。(定义±～+组为弱阳性组，++～+++为强阳性组)

　　5.统计学处理采用χ²检验

　　结　果

　　1.表皮生长因子(EGF)与食管癌

　　人的颌下腺作为阳性对照。可见反应呈棕褐色，阳性反应的部位主要为分泌管、小叶内导管及小叶间导管。管的腔面阳性反应较强。腺末房无颜色反应呈阴性(图1)。本实验中，34例食管癌组织均为食管鳞癌。根据EGF免疫反应的强弱的不同，分为弱阳性组(±～+)。强阳性组(++～+++)。根据EGF阳性反应类型的不同，食管癌又分为M型(即在同一癌组织切片中EGF着色程度不同)，D型(即在同一癌组织切片中EGF阳性染色均一)。

　　1.EGF同食管癌分级的关系：34例食管癌中，EGF强阳性18例(占53%)，其中Ⅰ级鳞癌6例，Ⅱ级鳞癌8例，Ⅲ级4例。弱阳性组16例(占47%)，其中Ⅰ级6例，Ⅱ级4例，Ⅲ级6例。P＞0.05(χ²检验)，显示差异无显著性(表1)。

表1　表皮生长因子与食管癌分级的关系

　　Table 1 Correlation between EGF and esophageal squamous cell carcinoma(SCC) grade

　　Ⅰ：高分化鳞癌 well differentiated squamous cell carcinoma(SCC)

　　Ⅱ:中分化鳞癌 moderately differentiated squamous cell carcinoma(SCC)

　　Ⅲ：低分化鳞癌 poorly differentiated squamous cell carcinoma(SCC)

　　EGF：表皮生长因子epidermal growth factor.

χ²=1.62 P＞0.05

　　1.2　表皮生长因子同食管癌淋巴结转移的关系：34例食管癌中，发生淋巴结转移的有17例。EGF样反应强阳性组中有14例发生淋巴结转移(图2)，EGF弱阳性组中3例有淋巴结转移。而在未发生淋巴结转移的病例中，强阳性组仅有4例，弱阳性组有13例(图3～5)。同时在转移的淋巴结中检测到较强的EGF反应(图6)。说明反应强阳性组发生淋巴结转移的机率明显大于弱阳性组(P＜0.01)(表2)。

　　1.3　EGF阳性反应强度与阳性反应类型的关系：34例食管癌中，反应类型为M型和D型者各为15例和19例(图2，3)。M型在强阳性组为11例，在弱阳性组为4例。D型在强阳性组和弱阳性组分别为7例或12例。强阳性组中M型多于D型(P＜0.05)(表3)。

表2　表皮生长因子与食管癌淋巴结转移的关系

　　Table 2 Correlation between EGF and lymph node metastasis

　　EGF:表皮生长因子 epidermal growth factor

　　n(+)：有淋巴结转移 lymph node metastasis

　　n(-):无淋巴结转移 no lymph node metastasis　

χ²=11.81 P＜0.01

表3　表皮生长因子阳性反应强度同阳性反应类型的关系

　　Table 3 Correlation between EGF and staining pattern

　　EGF：表皮生长因子 epidermal growth factor

　　M型：不均一型 mosaic pattern

　　D型：均一型 diffuse pattern

χ²=4.48 P＜0.05

　　2.表皮生长因子受体与食管癌

　　人胎盘组织阳性对照切片经ABC法染色后，胎盘绒毛膜合体滋养层细胞出现阳性反应(图7)。食管鳞癌组织中EGF-R和EGF表现出相似的免疫组织化学反应。有的癌组织中EGFR染色着色的程度不同称为M型(图8)，有的癌组织中EGFR染色均一，称为D型(图9)，阳性反应的部位主要是胞膜及胞质，也有在细胞核中出现的(图10)。这在以前还未见报道。在转移的淋巴结中也检测出较强的EGFR免疫反应(图11)。癌组织周围的细胞及间质无颜色反应为阴性。另外，在正常食管(断端组织)相当于棘细胞层的部位出现较强的阳性反应(图12)。

　　2.1　EGFR同食管癌分级的关系：34例中，强阳性18例，其中Ⅰ级鳞癌5例，Ⅱ级鳞癌9例，Ⅲ级4例。弱阳性组16例，其中Ⅰ级鳞癌7例，Ⅱ级3例，Ⅲ级6例。EGFR染色与食管癌分级差异无显著性(P＞0.05)。

　　2.2　EGFR阳性反应强度同食管癌淋巴结转移的关系：共有17例发生淋巴结转移，其中EGFR强阳性的有12例，EGFR弱阳性的有5例。在未发生淋巴结转移的病例中，EGFR免疫反应强阳性组中有6例未发生淋巴结转移，弱阳性组中11例未发生转移。在有鳞癌转移的淋巴结中同样检测出有较强的EGFR免疫反应(图11)，即EGFR强阳性组比EGFR弱阳性组更容易发生淋巴结转移。(P＜0.05)(表4)。

表4　表皮生长因子受体同食管癌淋巴结转移的关系

　　Table 4 Correlation between EGFR and lymph node metastasis

　　n(+):有淋巴结转移 lymph nodes metastasis

　　n(-)：无淋巴结转移 no lymph nodes metastasis

χ²=4.25 P＜0.05

　　2.3　表皮生长因子受体阳性反应强度同阳性反应类型的关系：34例中，M型15例，D型19例。M型在EGFR强阳性组与弱阳性组分别为10例和5例。D型在两组中分别为8例或11例。虽然强阳性组中M型较D型多，但未发现有统计学意义(P＞0.05)。

　　2.4　表皮生长因子(受体)阳性反应类型同淋巴结转移的关系：17例淋巴结转移的病例中M型为12例，D型为3例。在未发生淋巴结转移的病例中M型为3例，D型为14例，在发生淋巴结转移的病例中，表皮生长因子(受体)免疫反应类型为M型者明显多于D型(P＜0.01)(表5)。

表5　表皮生长因子阳性反应类型同淋巴结转移的关系

　　Table 5 Correlation between EGFR-IR pattern and lymph node metastasis

　　n(+):有淋巴结转移　lymph nodes metastasis

　　n(-)：无淋巴结转移　no lymph nodes metastasis

　　M型：不均一型 mosaic pattern D型：均一型 diffuse pattern

χ²=9.66 P＜0.01

　　讨　论

　　表皮生长因子及其受体与食管癌EGF通过与EGF受体结合，在细胞内传递中构成一个复杂的代谢网络，控制着细胞的代谢、生长、分化与癌变。

　　在实验中，34例食管癌组织的EGF和EGFR均有不同程度的表达。说明表皮生长因子同食管癌的关系密切。就其分布的部位来看，EGF和EGFR在食管癌细胞的胞膜、胞浆及胞核中均有表达。根据表皮生长因子与其受体的作用机制，可以认为，检测到的EGF或EGFR，可能就是被内转入胞浆的EGF与其受体的复合物。本实验未能证实结合的EGF是外源性的，还是细胞自身的分泌物。已有报道，在鳞癌的发生中存在有自分泌机制(autocrine system)。^［7］

　　关于EGF受体在核中分布有不少报道，用I¹²⁵标记的mEGF为探针，在肝细胞核发现了EGF的结合点^［8］。但食管癌细胞核中存在EGFR还未见报道。这可能同DNA的合成有关^［9，10］。表皮生长因子可以刺激c-fos,c-myc等原癌基因的转录与表达，已发现在食管细胞中c-myc基因的扩增，它们多为细胞核上的DNA结合蛋白，可以调节其他基因的表达。在实验中，正常上皮细胞核中没有发现有EGFR及EGF样免疫反应，而在某些食管癌细胞中，却发现有EGFR及EGF的表达。因此，我们可以认为，存在于细胞核中的EGFR同细胞的癌变有某种关系。

　　食管癌组织发生淋巴结转移的机率较大。在本实验中，34例食管癌发生淋巴转移者有17例(占50%)。无论是EGF还是EGFR，强阳性组发生淋巴结转移的明显多于弱阳性组。概率分别为P＜0.01和P＜0.05。另外，在免疫反应性的类型上，阳性反应表现为不均一型(M型)的比表现为均一型(D型)的较多地发生淋巴结转移P＜0.01，这可能是表现为M型的食管癌组织中EGFR的浓度不同所致。众所周知，淋巴结转移和肿瘤侵润深度是判定食管癌预后的重要因素。但因我们尚未进行临床追踪，我们只能初步认为，同时表达EGF及EGFR强阳性，以及反应类型为不均一型(M型)同食管癌病人的预后有关。

　　我们还发现在正常食管(断端正常组织)上皮的基底层及基底旁层细胞表皮生长因子及受体呈弱阳性反应，食管腺体未发现阳性反应，食管腺导管呈阳性反应，上皮的中间层相当于棘细胞层的部位却出现较强的阳性反应。Sato等提出，食管癌细胞可能起源于基底细胞和/或基底旁层细胞。本实验支持这种理论，因为在正常情况下，这些细胞具有较少的EGFR和EGF，而癌变的细胞却具有较多的EGFR和EGF。EGFR基因的扩增可能是其癌变的机制之一^［9］。因为已发现多种癌基因产物同EGFR具有高度同源性，另外，肿瘤细胞还能分泌一些生长因子，这些生长因子同EGF具有明显的免疫交叉反应。从而使EGFR持续受到刺激，使细胞发生转化。从某种意义上讲，细胞的癌变是以某种方式干扰或破坏生长因子的正常信号通路，使细胞的生长、分裂和分化从有控状态变为失控状态。至于棘细胞层的较强的阳性反应，可能是维持其本身细胞生长、分化所必须的。因而，EGF是诱导肿瘤的发生还是促进正常细胞生长，可能取决于作用的细胞的类型、内外环境以及EGF的浓度等因素。

图版说明

　　图1　正常人颌下腺，ABC法，EGF样免疫反应性 ×200

2　ABC法，EGF样免疫反应染色强阳性不均一型，(M型)。食管鳞癌Ⅰ级，有淋巴结转移 ×200

3　ABC法，EGF样免疫反应弱阳性，均一型(D型)。食管鳞癌Ⅲ级，无淋巴结转移 ×200

4　ABC法，EGF样免疫反应强阳性，均一型(D型)。食管鳞癌Ⅱ级，有淋巴结转移 ×200

5　ABC法，EGF样免疫反应弱阳性，(M型)。食管鳞癌Ⅱ级，无淋巴结转移 ×200

6　ABC法，EGF样免疫反应强阳性，(M型)。有转移的淋巴结 ×100

7　ABC法，EGFR样免疫反应性。正常人胎盘组织 ×200

8　ABC法，EGFR样免疫反应强阳性，(M型)。食管鳞癌Ⅰ级，有淋巴结转移 ×400

9　ABC法，EGFR样免疫反应弱阳性，(D型)。食管鳞癌Ⅰ级，未发生淋巴结转移 ×200

10　ABC法，EGFR样免疫反应性。可见个别细胞核中出现阳性反应颗粒 ×400

11　ABC法，EGFR样免疫反应性。转移的淋巴结，(M型) ×100

12　ABC法，EGFR样免疫反应性。正常食管上皮 ×200

Explanation of figures

　　Fig.1 EGF-IR in normal human submandibular gland, ABC method ×200

　　Fig.2 Strongly expressed EGF-IR appeared as mosaic (M) pattern in human esophageal squamous cell carcinoma(grade Ⅰ) with lymph node metastasis. ABC method ×200

　　Fig.3 Faintly expressed EGF-IR appeared as a diffuse (D) partten in human esophageal squamous cell carcianoma (grade Ⅲ) without lymph node metastasis. ABC method ×200

　　Fig.4 Strongly expressed EGF-IR appeared as a diffuse (D) pattern in human esohpageal squamous cell carcinoma (gradeⅡ) with lymph node metastasis. ABC method ×200

　　Fig.5 Faintly expressed EGF-IR appeared as a masaic (M) pattern in human esophageal squamous cell carcinoma (grade Ⅱ)without lymph node metastasis. ABC method ×200

　　Fig.6 Strongly expressed EGF-IR appeared as a mosaic (M) pattern in the metastatic lymph node. ABC method ×100

　　Fig.7 EGFR-IR in normal human placenta tissues. ABC method ×200

　　Fig.8 Strongly expressed EGFR-IR appeared as a mosaic (M) pattern in human esophageal squamous cell carcinoma (grade Ⅰ) with lymph node metastasis. ABC method ×400

　　Fig.9 Faintly expressed EGFR-IR appeared as a diffuse (D) pattern in human esophageal squamous cell carcinoma (grade Ⅰ) without lymph node metastasis. ABC method ×200

　　Fig.10 EGFR-IR appeared in some nucleus. ABC method ×400

　　Fig.11 EGFR-IR appeared as a mosaic partten in the metastatic lymph node. ABC method ×100

　　Fig.12 EGFR-IR in normal human esophageal epithelia. ABC method ×200

　　△ Department of Histology and Embryology, Henan Medical University, Zhengzhou 450052, China

　　 参考文献

　　［1］Cohen S. Purification and metabolic effects of a nerve growth-promoting protein from snake venom. J Biol Chem, 1959,234(5):1129

　　［2］Ozawa S, Uede M, Ando N, et al. Epidermal growth factor receptors in cancer tissues of esophagus, lung, pancreas, colorectum, breast and stomach. Jpn J Cancer Res (Gann), 1988,79(11):1201

　　［3］陈元方，侯雪，潘国宗，等.人胰腺癌表皮生长因子及受体研究.中华消化杂志，1989，9(3)：127

　　［4］Mansour EG, Ravdin PM, Dressler L. Prognostic factor in early breast carcinoma, Cancer, 1994,74(1)suppl:381

　　［5］Yasui W, Hata J, Yokozaki H, et al. Interaction between epidermal growth factor and its receptor in progression of human gastric carcinoma. Int J Cancer, 1988,41(2):211

　　［6］Zhao X, Wang X, Zhou C, et al. Abrupt reduction of c-myc expression by antisense RNA including terminal differentiation and apoptosis of a human esophageal cancer cell line. Sci China B, 1995,38(5):580

　　［7］Sporn MB, Roberts Ab. Autocrine growth factors and cancer. Nature, 1985,313(28):745

　　［8］王会信，薛沿宁，周廷冲.生长因子受体研究概况.国外医学分子生物学分册，1991，13(5)：205

　　［9］Ozawa S, Ueda M, Ando N, et al. High incidence of EGF receptor hyper production in esophageal squamous cell carcinomas. Int J Cancer, 1987,39(3):333

　　［10］陈图兴，孙宏训.表皮生长因子、胰高血糖素及胰岛素对大鼠初代培养肝细胞DNA合成影响的初步观察.中华消化杂志，1988，8(4)：216.

收稿1997-11　修回1998-09