人乳头瘤病毒DNA在原发性肺癌组织中的表达

　　第四军医大学学报1999年第20卷第9期

戚好文　陈卫强　李焕章

　　摘　要　目的：探讨人乳头瘤病毒（HPV）DNA在原发性肺癌组织中的表达.方法：利用西京医院病理科275例肺癌病理标本进行研究，以同期32例支气管粘膜鳞状化生和34例粘膜慢性炎症标本作为双非肿瘤对照组.采用随机引物法制备地高辛标记HPV6B/11，16，18，31型DNA探针，应用原位杂交检测肺癌组织中的HPV-DNA存在情况.结果：HPV原位杂交阳性信号位于组织细胞核内.肺癌HPV感染总阳性率为33.8%（93/275）而各细胞类型阳性率为：肺鳞癌48.5%，腺癌18.0%，小细胞癌20.2%，大细胞肺癌33.3%，鳞状上皮化生不典型增生21.9%，粘膜慢性炎症5.9%.以粘膜炎症组为对照，肺鳞癌阳性率最高，与对照组相比差异性显著.肺鳞癌组织中HPV各型阳性率HPV6B/11为21.6%，HPV16为20.2%，HPV18为23.8%，HPV31为19.0%,各型之间差异不显著.结论：肺鳞癌、腺癌、小细胞癌、大细胞癌中均存在不同程度HPV感染，肺鳞癌与HPV感染关系密切.

　　关键词：人乳头瘤病毒　肺肿瘤　原位杂交

　　0　引言

　　肺癌发病率和死亡率在世界许多国家都呈增长的趋势.在肺癌的病因学研究中，有关肿瘤病毒与肺癌的关系受到人们广泛重视.人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)作为DNA肿瘤病毒与宫颈癌的关系已为人们所熟悉.然而近年来，国内外许多研究者开始关注人乳头瘤病毒感染与肺癌的相关性及其可能致瘤机制.根据流行病学调查,许多学者认为HPV感染与部分肺癌发生发展有关^［1～4］，但也有少数学者持相反意见^［5］.为获得本地区HPV感染与肺癌相关的流行病学资料，我们采用较大样本病理标本资料，利用地高辛标记DNA探针行原位杂交检测，探讨HPV感染与肺癌的相关性.

　　1　材料和方法

　　1．1　材料　标本取自西京医院病理科1992-03～1997-03存档标本，均为纤维支气管镜活检或手术切除标本，经100mL/L中性福尔马林固定,石蜡包埋，常规HE染色切片经病理确诊.5μm连续切片被覆于预涂APES胶载玻片，60℃烘烤过夜备用.共取标本341例，其中：鳞癌134例、腺癌56例、小细胞癌79例,大细胞癌6例,支气管粘膜上皮鳞状化生32例,支气管粘膜慢性炎症34例.平均年龄(岁)：鳞癌58,腺癌57,小细胞癌53,大细胞癌55,粘膜慢性炎症53.其余临床资料来自支气管镜申请单及病历资料.主要试剂:10×buffer4×dUTPTaqDNA聚合酶华美生物工程公司.蛋白酶K,Tritonx-100,鲑精DNA（SSDNA）美国Sigma公司.地高辛DNA标记和检测试剂盒德国BoenringerMannheim公司.HPV6B/11型全基因质粒美国FoxChase癌症研究中心惠赠.HPV16,18,31全基因质粒由德国海德堡癌症研究中心DeVillers教授惠赠.HPV6B/11,16,18,31型特异引物由中国科学院上海生物工程研究所合成.引物设计参考文献［4］.

　　1．2　方法　PCR及HPV-DNA提取纯化鉴定在本校分子生物学研究所完成.产物由低溶点琼脂糖电泳回收，DNA纯化试剂盒纯化，探针标记按照试剂盒操作说明书进行原位杂交.①组织前处理：切片常规脱蜡入PBS，0.2mol/LHCl酸化10min，5g/L蛋白酶K消化组织，37℃，10min.梯度酒精脱水，空气干燥组织切片.②原位杂交：滴加含各型HPV探针的杂交液于组织切片上，加热95℃使探针及病毒DNA变性，然后迅速置于冰上骤冷后将切片置于盛有2×SSC的湿盒内，置42℃恒温水浴箱中杂交过夜，2×SSC，1×SSC，0.5×SSC，bufferI振洗；滴加碱性磷酸酶标记的地高辛抗体复合物bufferI振洗；置暗处显色.10min定时抽查切片镜下观察其显色情况，常规酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固.③对照实验：阴性对照已知不含HPV之肝组织切片.空白对照：用不含探针的预杂交液代替含有HPV型探针的杂交液.阳性对照:用已知HPV阳性的尖锐湿疣组织及宫颈癌组织.光镜下观察原位杂交结果，阳性结果细胞核呈紫蓝色，结果统计及处理采用Fisher精确检验和χ²检验.

　　2　结果

　　HPV原位杂交结果，光镜下观察原位杂交阳性信号为紫蓝色颗粒，位于细胞核内，阳性信号在组织内分布不均匀，不同区域阳性细胞数量及信号强弱不等.近表面组织阳性信号略强且阳性细胞数目较多，有些阳性细胞呈凹空样变，细胞核周有短毛刺状突起（Fig1～3）.

图1　支气管粘膜上皮鳞状化生不典型增生组织，HPV-DNA原位杂交，阳性信号位于胞核内

　　fig1　HPV-DNA in situ hybridization in bronchial metaplasia

　　organization,positive signal located in nuclei　×400

图2肺癌组织HPV-DNA原位杂交，胞核阳性

　　fig2　HPV-DNA in situhybridization in lung cancer,

　　positive signal located in nuclei　×400

图3　肺癌组织HPV-DNA原位杂交，胞核阳性

　　fig3　HPV-DNA in situ hybridization in lung cancer,

　　positive signal located in nuclei　×400

　　2.1　各类肺组织中HPV-DNA检出情况　肺癌病理标本275例，HPV-DNA阳性者93例，其阳性率为33.8%.各种类型细胞HPV-DNA检出情况详见Tab1.

表1　各类肺组织HPV原位杂交结果

　　tab1　　Results　of　HPV　in　situ　hybridization　in　lung　tissues

　　^bP＜0.01 vs CIBM.SQCC=squamous carcinoma;AC=adenocarcinoma;SCLC=small cell lung cancer;LCLC=large cell lung cancer;SM=squamous metaplasia;CIBM=chronic inflammation of bronchial mucosa.2.2　肺癌中各型HPV检出情况　各型HPV阳性率无差别(P＞0.05,Tab2).

表2　肺癌组织中各型HPV阳性率

　　tab2　Positive rate of different types of HPV inlung cancer　　　(n,%)

　　2.3　肺鳞癌各期HPV检出情况　各期肺鳞癌HPV表达无差异(Tab3).

表3　肺鳞癌各期HPV原位杂交检测结果

　　tab3　Results of HPV-DNA in situ hybridization

　　2.4　肺鳞癌HPV与性别、吸烟的相关性　肺鳞癌HPV感染阳性者65例，其中男41例（63.0%），女24例（37.0%）.在134例肺鳞癌患者中，其中吸烟者107例，HPV感染者53例（49.5%），非吸烟者27例，HPV感染者12例（40.1%）.上述肺鳞癌HPV感染阳性患者，无论从性别比较，还是从吸烟与非吸烟者相比，经卡方检验，均无显著差异.3　讨论

　　目前有关HPV感染与肺癌关系的研究越来越深入并受到广泛重视，但是由于研究方法不同，患者所在地区不同，所得的结果也不尽相同，差异很大，而且有些结果持相反的观点^［5］.本研究采用地高辛标记HPV-DNA探针原位杂交方法所得结果有以下几个特点.

　　3.1　肺癌细胞类型与HPV　鳞癌、腺癌、小细胞未化分癌及大细胞未分化肺癌组织中存在着不同程度的HPV感染，但以肺鳞癌的检出率最高（48.5%）.许多学者报道HPV感染与肺鳞癌有关，而很少与腺癌、小细胞未分化癌及大细胞未分化癌有关，如Samuel等^［2］所报道的46例肺癌中，肺鳞癌的阳性率为30.0%（6/20），大细胞未分化癌癌阳性率为16.0%（1/6）.然而腺癌16例及小细胞未分化癌4例均未发现HPV阳性信号.Soini等^［4］在43例的研究中，肺鳞癌28例中，有9例阳性，腺癌12例中4例阳性.而小细胞肺癌3例均为阴性.张火　亘等^［6］在对34例肺癌研究中，仅发现12例鳞癌中有3例HPV阳性，其余各种细胞类型均阴性.造成以上差别的原因可能与样本数多少有关，本研究采用275例不同细胞类型的肺癌组织.由于样本数大，其实验结果比较可靠，其他学者研究的样本数量很小.另外的原因是与一些学者专门研究HPV感染与肺鳞癌的关系，不研究与其它细胞类型的相关性.

　　3.2　肺癌与HPV分型的关系　依据核酸杂交同源性，HPV已分离鉴定超过70种以上.在对宫颈癌的研究中，一般以HPV16，HPV18型作为高危险致瘤代表，而一些学者在对肺癌HPV感染研究中亦检测HPV16，HPV18型为主^［3］，其它型别研究较少.在本研究中，将HPV型别扩展到HPV6B/11，16，18，31型.其各型检出率相近，经统计学检验无显著差异，HPV16，18型别亦无明显优势.这是否与本地区HPV流行病学特征有关，需要进一步研究.

　　3.3　肺鳞癌组织分化程度与HPV感染的相关性　我们发现肺鳞癌HPV的感染率为48.5%.依据鳞癌的分化程度，可分高分化型（Ⅰ°角化型），低分化型（Ⅱ°非角化型）和未分化型（Ⅲ°）三种类型.本组资料表明非角化型最多，占60.0%，Tab3可以看出各期肺鳞癌均存在有HPV感染，但检出率无显著差异，说明HPV感染与肺鳞癌病理分期无明显关系.根据文献检索到目前为止，在研究HPV感染与肺癌的关系方面，设立对照研究组，仅见Sonin等^［4］的报道，他在研究中，设立46例为研究组和17例支气管粘膜鳞状化生为对照组.在17例中仅发现1例HPV阳性.设立对照组目的，有利于全面、客观、正确评价HPV感染与肺癌的关系.在我们的研究中设立两种对照组：支气管粘膜慢性炎症组34例，鳞状化上皮化生32例，有助于初步了解HPV感染与肺癌发生、发展的过程.目前认为，肺鳞癌的发生可能由于上皮反复的损害和慢性感染，柱状上皮失去了纤毛，外来致癌物质在该部沉积吸收，然后发生化生—增生—不典型增生—原位癌—癌.研究结果表明，粘膜慢性炎症HPV感染检出率为5.9%，鳞状上皮化生为21.8%，肺鳞癌为48.5%，提示支气管粘膜慢性炎症，鳞状上皮化生到肺鳞癌的过程中始终与HPV相伴行.HPV感染呈上升趋势，符合肺鳞癌发生发展的变化，HPV感染可能在肺鳞癌发生过程中起着某种作用.我们对大量的肺癌感染HPV的病理标本研究结果显示，HPV原位杂交阳性信号位于细胞核内，提示HPVDNA可能处于整合状态.不同区域阳性细胞数量及阳性信号强弱不尽相同，表明病毒感染分布不均匀.部分病例肿瘤组织中杂交阳性细胞的分布也与湿疣病变中分布特点相似，愈近表面杂交阳性细胞数量较多,核内信号越强,表明组织表面含有较多的病毒拷贝数.部分杂交阳性细胞相似于生殖湿疣病变的凹空细胞，表明HPV感染可能与肺鳞癌的某些组织学特征有关，有些凹空细胞核周空晕区胞浆细丝亦存在阳性现象，上述所观察到的病理改变为今后对肺癌感染HPV病理标本的诊断进一步提供了借鉴.肺癌的发生是一个多因素、多基因、多步变过程.HPV感染可能在肺癌的发生发展中起某种作用，这些都需要在今后研究中获得证实.

　　致　谢　本研究得到病理教研室黄高升主任、晏培松教授、王剑波及马福成主管技师的大力指导及协助，特此致谢.

　　基金项目：全军“九^．五”医药卫生科研基金资助项目　No.96.M107

　　作者简介：戚好文，男，1941-07-21生，河南省郑州市人，汉族.1966年第四军医大学医疗系毕业，教授,主任医师，科主任.电话:（029）3375233

　　作者单位：第四军医大学西京医院呼吸内科，陕西　西安710033

　　参考文献

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　　3 Kinoshita I, Dosaka-Akita H, Shindoh M et al. Human papillomavirus type 18 DNA and E6-E7 mRNA are detected in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the lung. Br J Cancer, 1995;71(1):344-349

　　4 Soini Y, Nuorva K, Kamel D. Presence of human papillomavirus DNA and abnormal P53 protein accumulation in lung carcinoma. Thorax, 1996;51(3):887-893

　　5 Kwun M. Human papillomavirus not found in squamous and large cell lung carcinomas by ploymerase chain reaction. Cancer, 1995;75(7):2400

　　6 张　火　亘, 朱元珏，李云芸et al. 肺癌中p53基因突变分析及人乳头瘤病毒检测. 中华内科杂志, 1995；34（10）：73