非小细胞未分化肺癌ras-p21免疫荧光测定 及其与术后预防性放射治疗的关系

　　中华放射医学与防护杂志1999年第1期

张红星　吕宁　郭蕾　王顺宝

　　 关键词:肺癌　非小细胞型　ras-p21蛋白　表达 术后放疗

　　分子生物学研究证明，正常细胞中原癌基因变异，导致细胞正常增殖和分化紊乱，引起细胞恶变，最终形成癌瘤。与肺癌相关的原癌基因，已发现多种，具有同源碱基序列的K-ras\,H-ras和N-ras的ras族基因活化，主要见于非小细胞型肺癌。其突变检出率约30%，表现为ras-p21蛋白阳性表达。我们应用免疫荧光测定法，检测39例非小细胞型肺癌组织的ras-p21蛋白表达，分析与术后局部预防性放疗关系。

　　一、材料和方法

　　1.临床资料

　　病例来源于我院1995年3月24日～1995年11月9日行肺癌根治术患者，选择手术和病理分期均为Ⅲ_A病例39例，男性30例，女性9例。年龄30～69岁，中位年龄57岁。病理诊断鳞癌23例，腺癌13例，腺鳞癌3例。术后2周内信封法随机分为单一手术或术后放疗组。放疗组病例在分组后2周内开始照射，6MV X射线，照射野范围为全纵膈和气管切缘，前后对穿D_T 40Gy后，双侧水平野推量D_T 20Gy，总剂量D_T 60Gy/6周，共30次。

　　2.测定方法

　　(1)标本制备：①取0.3cm×0.3cm×0.3cm经福尔马林固定的手术切除肺癌组织块，剪碎。用100%、95%、70%、50%酒精梯度水化，处理10分钟，弃上清，加3 ml双蒸水，3～5分钟后弃上清。②加1 ml PBS,用组织匀浆器研磨成单细胞悬液，PBS洗2次。2000r/min 2～3分钟，弃上清。取细胞2×10⁶/ml，200目尼龙网过筛。

　　(2)抗体作用：①一抗与二抗：一抗是小鼠单抗C-H-ras (F₂₃₅)(Santa Cruz Biotechnology Inc.中山公司经销)，只与C-H-ras-p21起反应，与C-K-ras-p21或C-N-ras-p21无交叉反应。二抗为FITC荧光标记抗鼠IgG(Jackson Immunoresearch Laboratories' Inc.中山公司经销)，不含抗非免疫球蛋白血清蛋白的抗体。②加50μl 0.15μg/100μl一抗于上述细胞中，再加入含0.5%牛血清白蛋白的50μl PBS，充分混匀，于37℃孵育30分钟，PBS洗2次，弃上清。③加50μl 2.25μg/100μl二抗于经一抗作用过的细胞中，再加入含0.5%牛血清白蛋白的PBS 50μl，37℃孵育30分钟，用PBS洗2次，弃上清,4℃保存，24小时内荧光测定。

　　(3)荧光测定：①样品用FACS_can流式细胞仪(北京医科大学流式细胞仪室提供)测定。激发光488 nm,发射光530～535 nm，计算各样品的FI值。

　　FI值=

　　FI值＞1为ras-p21表达阳性，FI值＜1为阴性。②阳性和阴性对照：阳性对照用预实验的阳性标本，阴性对照用正常人的淋巴细胞不加一抗。

　　3.统计方法

　　统计学处理用χ²检验，生存率为卡-迈曲线。

　　二、结果

　　39例中19例(48.7%) ras-p21蛋白表达阳性。阴性表达20例中2例疗后即刻失去随访，均为单一手术组病例，可供分析37例，随诊至1997年12月30日，均满2年，随诊率95%。均未行化疗。

　　全组表达阳性病例2年存活率47.4%(9/19)，阴性44.4%(8/18)。单一手术组22例中8例(36.4%)2年存活，术后放疗组15例中9例(60%)2年存活。ras-p21表达与不同治疗方式的存活曲线见图1、2。表达阳性病例，术后放疗组中42.9%(3/7)野内复发，阴性仅12.5%(1/8)野内复发。单一手术组分别33%(4/12)和30%(3/10)局部复发。

图1　肺癌病人ras-p21阳性不同治疗方式2年存活曲线

图2　肺癌病人ras-p21阴性不同治疗方式2年存活曲线

　　 三、讨论

　　通过NIH/3T3细胞转化实验，首次确认了包括扩增、缺失和点突变等激活的ras基因^［1］。研究证明ras基因激活与多种癌症有关，只是程度不一^［2］。与肺癌相关研究，主要集中于K-ras表达和癌生物行为及治疗效果方面，多数作者报告K-ras表达阳性肺癌预后差^［3-6］。H-ras与肺癌关系的报道尚未见到。本研究发现，H-ras-p21表达率较K-ras略高。虽然全组病例的肺癌生物行为和2年存活率同ras-p21表达无关，但表达阴性病例术后放疗组局部控制率比单一手术组高18%，2年存活率高33%。阳性病例术后放疗组局部控制率反而比单一手术组低10%，2年存活率仅高5%。此组照射野内复发较表达阴性术后放疗组高30%。因病例数少无统计学意义，仍能看出ras-p21表达阳性病例，尽管术后接受了根治剂量预防照射，未能降低局部复发。可能因局部残存的p21表达阳性癌细胞放射抗拒，造成术后预防放疗无效。Mitsudomi等报道ras基因突变的肺癌预后差，与是否行放射治疗无关^［3］。Antonio等也观察到p21蛋白表达影响放化疗效果现象^［7］。

　　ras基因突变，p21蛋白阳性表达与非小细胞型肺癌临床治疗和预后关系目前仍不甚明了，因多数研究者报告ras基因突变的肺癌生物行为恶劣，有作者建议应对这些患者加强治疗^［3］，但美国临床肿瘤学会近期发布的非小细胞型肺癌治疗指导中依然提出不能把ras基因突变因素当作制定治疗方针的依据^［8］。本研究也证明ras基因表达与预后关系不明显，只可能与放射抗拒有关。ras基因突变的基础研究结果，能否同临床治疗相结合，仍有待进一步探讨。

　　本课题受中国医学科学院中国协和医科大学院校长基金CNB资助

　　作者单位：100021　北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放疗科

　　参考文献

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　　[2]Bos J.Ras oncogene in human cancer:a review.Cancer Res,1989,49:4682-4689.

　　[3]Mitsudomi T,Steinberg SM,Oie HK,et al.Ras gene mutations in non-small cell lung cancers are associated with shortened survival irrespective of treatment. Cancer Res,1991,51:4999-5002.

　　[4]Rafael R,Shanrong L,Zdenek SK,et al.Prognostic impact of mutated K-ras gene in surgically resected non-small cell lung cancer patients.Oncogene,1993,8:2407-2412.

　　[5]Rosenkuis S,Slebos R,Boot A,et al.Incidence and possible clinical significance of K-ras oncogene activation in adenocarcinoma of the human lung.Cancer Res,1988,48:5738-5741.

　　[6]Shanrong L,Rafael R,Antonio U,et al.K-ras gene point mutation:a stable tumor marker in non-small cell lung carcinoma. Lung Cancer,1994,11:19-27.

　　[7]Antonio M,Claudio D,Mattia B,et al.p21 RNA and protein expression in non-small cell lung carcinomas:evidence of p53-independent expression and association with tumoral differentiation.Oncogene,1996,12:1319-1324.

　　[8]American Society of Clinical Oncology.Clinical practice guidelines for the treatment of unresectable non-small cell lung cancer.J Clin Oncol,1997,15:2996-3018.