P16蛋白和视网膜母细胞瘤蛋白在106例患者肺癌组织中的表达

中华结核和呼吸感染 2000年第10期第23卷 论　著

作者：秦建文　陈光瑾　王新允

单位：秦建文(300051 天津胸科医院胸内科)；陈光谨(天津总医院呼吸科)；王新允(天津医科大学病理教研室)

　　关键词： 肺癌；P16；视网膜母细胞瘤

　　【摘要】　目的　探讨P16和视网膜母细胞瘤（Rb)蛋白表达与肺癌细胞增殖的关系及其临床意义。方法　应用免疫组化技术检测了66例非小细胞肺癌（NSCLC）和40例小细胞肺癌（SCLC）患者肺癌组织中P16蛋白和Rb蛋白表达。结果　NSCLC中P16蛋白与Rb蛋白的表达呈显著负相关（χ²=10.52，P＜0.01）。P16蛋白或Rb蛋白的表达与肺癌分期、分化程度、病理分型、淋巴结转移无明显相关（P＞0.05）。SCLC中Rb蛋白表达的缺失率（78%）与NSCLC(21%)比较，差异有显著性(χ² =32.3，P＜0.01)。结论　Rb蛋白在SCLC中的高缺失率使之可能成为SCLC诊断的重要参考指标。 在NSCLC中P16蛋白与Rb蛋白的表达呈负相关，进一步证实了在G₁期调节过程中P16与Rb之间存在着负反馈环路。

The expression of P16 and Rb proteins in 106 cases of lung cancer

QIN Jianwen, CHEN Guangjin, WANG Xinyun.

　　(Thoracic Department, Tianjin Thoracic Hospital, Tianjin 300051, China)

　　【Abstract】　Objective　To observe the relationship between the expression of P16 and Rb proteins and the proliferation of lung cancer cells.Methods　The expressions of P16 and Rb proteins were measured in 66 cases of NSCLC and 40 cases of SCLC by means of immunohistochemistry technique. Results　The inverse correlation of Rb and P16 proteins expression was confirmed in 66 cases of NSCLC (χ²=10.52，P＜0.01). No relationship between the expression of P16 and differentiation, stage, lymph node metastasis or pathological type was found (P＞0.05). There was no correlation between the expression of Rb and differentiation, stage, lymph node metastasis or pathological pattern (P＞0.05). The frequency of the loss of Rb protein expression in SCLC (78%) was significantly higher than in NSCLC (21%, χ²=32.3,P＜0.01). Conclusions　Loss of Rb protein expression in SCLC may be an important marker of the diagnosis of SCLC. The expression of P16 adversely correlates with that of Rb. This study provides strong confirmation about that there might be a negative feedback between P16 and Rb in phase G₁.

　　【Key words】　Lung cancer；　P16；　Retinoblastoma

　　近年来研究^［1，2］表明，P16和视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白在多种肿瘤中均存在不同程度的缺失，在肺癌中的表达缺失亦有报道^［3］。但对二者在调节肿瘤细胞增殖过程中的相互关系尚未有统一认识，尤其在小细胞肺癌(SCLC)中的表达报道甚少^［4］。我们应用免疫组化技术检测106例原发性支气管肺癌患者组织中P16和Rb蛋白的表达，并结合临床病理多项指标进行综合分析，探讨P16和Rb在肺癌发生发展中的作用及其临床意义，从而为今后的肺癌基因治疗提供理论依据。

　　材料与方法

　　一、材料

　　106例原发性支气管肺癌标本取自天津医科大学总医院1988～1997年门诊和住院患者。活组织检查(活检)标本30例，手术标本76例。患者中男68例，女38例，年龄（57±11）岁。其中非小细胞肺癌（NSCLC）66例（鳞癌32例，腺癌34例；活检20例，手术标本46例），小细胞肺癌40例。临床分期根据1997年第八届国际肺癌大会公布的TNM分类标准^［5］，仅统计手术切除病例并结合术前和术后资料进行综合分析，NSCLC Ⅰ期14例，Ⅱ期18例，Ⅲ期14例。淋巴结转移情况仅统计NSCLC手术切除标本有明确病理诊断的病例，淋巴结转移阳性22例，阴性18例。术前均未经放、化疗。10例正常肺组织取自1998年4～11月天津胸科医院手术切除的肺组织，均经组织病理学检查证实。

　　链霉卵白素-过氧化酶(SP)试剂盒购于北京中山生物技术公司。其包括封闭用山羊血清，生物素标记二抗，辣根酶标记链霉卵白素，一抗P16抗体为兔抗人多克隆抗体，克隆号M-156，使用浓度为1∶150。Rb抗体为兔抗人多克隆抗体，克隆号C-15，使用浓度为1∶150。均为美国Santa Cruz公司产品。

　　二 、方法

　　1．标本制备：标本于术后即经10%中性甲醛液固定，56 ℃石蜡包埋，每例石蜡标本作连续切片，制成4 μm厚备染。每例标本均选出一张进行苏木素染色，经病理医师在未知先前诊断的情况下进行复诊核实。

　　2．免疫组化链菌素亲生物蛋白过氧化酶连接法（SP法）：标本经过脱蜡至水，热平台抗原修复加热至92～98 ℃，保持10 min，1∶20正常羊血清封闭湿盒内，室温30 min，加一抗湿盒4 ℃过夜，次日恢复室温40 min，滴加二抗（1∶200），室温1 h，滴加辣根酶标记链霉卵白素（1∶100），室温1 h，二氨基联苯胺显色，以阳性片显色强度进行染色时间控制，苏木素复染，脱水透明，封片。

　　3．实验对照：以正常血清取代第一抗体作替代对照，以生理盐水替代一抗作空白对照，以已知有P16 、Rb蛋白表达的宫颈粘膜切片作为阳性对照。

　　4．染色结果判定：P16阳性染色为胞质或胞核棕黄色颗粒沉着，Rb染色阳性为胞核棕黄色颗粒沉着，阴性切片无阳性物质出现。

　　5．统计学处理：应用χ² 检验和确切概率法。

　　结果

　　10例正常肺组织P16、Rb蛋白表达均未见缺失。

　　一、NSCLC组织中P16、Rb蛋白的表达及其与NSCLC临床病理特征的关系

　　NSCLC中P16蛋白表达的缺失率为45%(30/66)，Rb蛋白表达的缺失率为21%(14/66)，两种蛋白的表达与肺癌病理分型、分化程度、分期及淋巴结转移均无相关性（表1，图1，2）。

　　二、P16、Rb蛋白表达在NSCLC与SCLC中的比较

　　Rb蛋白的表达在NSCLC与SCLC中差异有显著性（χ²=32.3，P＜0.01），即SCLC组Rb蛋白的表达缺失率显著高于NSCLC组。P16蛋白在NSCLC中的表达缺失率略高于SCLC组，但统计学上差异无显著性（χ²=2.486，P＞0.05，表2）。

表1　NSCLC临床病理特征与P16、Rb蛋白表达的关系

　　注：经χ²检验或确切概率法检验，P均＞0.05

表2　P16、Rb蛋白表达在NSCLC与SCLC中的比较

　　三、NSCLC组织中P16、Rb蛋白表达的相关性

　　NSCLC组织中P16、Rb蛋白表达具有明显负相关(χ²=10.25，P＜0.01，表3)。

表3　NSCLC组织中P16、Rb蛋白表达的相关性(例数)

　　四、SCLC组织中P16、Rb蛋白表达的相关性

　　SCLC组织中P16、Rb蛋白表达无明显相关性(χ²=1.154，P＞0.05，表4)。

表4　SCLC组织中P16、Rb蛋白表达的相关性(例数)

　　讨论

　　随着分子生物学和分子遗传学对肿瘤研究的进一步深入，人们越来越注意到细胞增殖周期失调在肿瘤发生发展中的作用。细胞周期G₁→S→G₂→M期的进展需要一些“起始”和“终止”信号实施调控。真核细胞周期的控制有赖于细胞周期素依赖性激酶（CDK）的顺序活化以调节周期中各时相的转换。在细胞周期中，从G₁～S期的转变关系到整个细胞周期的启动，目前发现G₁期的调节因子与癌变关系最为密切，因此，对G₁期启动点的研究已成为当今热点。在G₁期启动点的调节过程中，正调控因子目前已知有CyclinD1，CDK₄等，负调控因子有P16、P53、P21等^［1］。在正常细胞周期G₁期，CyclinD1与CDK₄结合使CDK₄被激活，作用于Rb基因产物使其磷酸化，去除了其阻碍细胞周期的作用，使与Rb基因产物结合的转录因子E2F释放出来，细胞即由G₁期过渡到S期^［2］。P16蛋白可竞争性结合CDK₄，使其保持失活状态，从而抑制Rb蛋白的磷酸化 ，阻止细胞周期的进行。 Tam 等^［6］研究发现，磷酸化的Rb蛋白通过释放E2F不仅能促进细胞由G₁期进入S期，还促进P16的转录，进而抑制CDK₄的活性。因此推断P16、Rb与CyclinD1-CDK₄之间存在负反馈环路，对细胞由G₁期进入S期起调控作用。

　　本组研究发现，NSCLC组织中P16蛋白表达缺失率为45%，Rb蛋白表达缺失率为21%，与国外文献报道一致^［3］，P16与Rb的表达呈显著负相关，进一步证实了p16、Rb两种基因通过同一路径起作用，它们之间存在负反馈调节机制。Rb蛋白的失活导致P16蛋白表达的增加，与Shapiro等^［4］的研究结果一致。他对9例Rb蛋白阳性的NSCLC细胞株进行检测，发现6例P16蛋白缺失，另3例显示了较低水平。但是，p16基因失活为什么仅发生在Rb蛋白阳性的肿瘤中，目前机制尚不清楚，还需进一步研究。

　　在观察P16蛋白表达与肺癌临床病理特征时发现，P16蛋白的表达与肺癌病理分型、分期、分化程度、淋巴结转移无关。这一点与有些作者的研究结果不一致。Okamoto等^［7］报道，检测25例原发性NSCLC和22例转移性NSCLC，发现只有6例转移性NSCLC p16基因突变，提示p16基因失活在NSCLC中属于迟发事件。本组研究与Sakaguchi等^［8］的研究结果一致。推测这种基因与蛋白研究结果的分歧可能与DNA甲基化等有关，即在发生p16基因改变之前即可有转录以上水平的失活存在。

　　另外Shapiro等^［4］对5例Rb蛋白阴性的SCLC细胞株进行检测，均发现p16基因的高水平表达，5例SCLC原发肿瘤中检测到4例存在p16基因的高水平表达。

　　本组结果发现，P16蛋白在SCLC组织中的缺失率为30%， Rb蛋白缺失率为78%，略低于Shimizu等^［9］报道的Rb缺失率（88%）。Rb蛋白缺失率在SCLC中明显高于NSCLC。SCLC中P16蛋白缺失率低于NSCLC，但统计学差异无显著性。可见Rb在SCLC与NSCLC中所起的作用可能不同。SCLC中未发现P16与Rb蛋白表达的相关性，在Rb蛋白表达阴性的31例SCLC中，23例P16蛋白表达阳性，8例P16蛋白表达阴性。但这并不否认其基因水平的负反馈调节环路存在的可能。

　　综上所述Rb蛋白的检测有可能成为SCLC诊断的重要参考指标。我们推测在p16或Rb基因转录以上水平存在某些调节机制，导致p16或Rb的失活。因此，在SCLC中我们还有大量的研究工作要进行，从不同水平揭示其与SCLC发生、发展的关系，为今后基因治疗的发展打下良好理论基础。

图1　低分化腺癌中免疫组化P16染色胞浆呈棕黄色　SP　×200

　图2　高分化腺癌中免疫组化Rb

　　染色胞核呈棕黄色　SP　×200

参考文献

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　　6.Tam SW, Shay JW, Pagano M,et al.Differential expression and cell cycle regulation of the cyclin-dependent kinase 4 inhibitor p16^INK4. Cancer Res , 1994, 54 : 5816-5820.

　　7.Okamoto A, Hussain SP, Hagiwara K,et al.Mutation in the p16^INKN2 /MTS1/CDKN2. p15^INK4B /MTS2 and p18 genes in primary and metastatic lung cancer. Cancer Res, 1995,55: 1448-1451.

　　8.Sakaguchi M,Fujii Y, Airabayashi H,et al.Inversely correlated expression of P16 and Rb protein in non-small cell lung cancers :an immunohistochemical study.In J Cancer,1996,65:442-445.

　　9.Shimizu E ,Coxon A,Otterson GA,et al. Rb protein status and clinical correlation from 171 cell lines representing lung cancer ,extrapulmonary small cell carcinoma and mesothlioma.Oncogene,1994,9:2441-2448.

(收稿日期：2000-03-27)