胰腺癌组织表皮生长因子mRNA表达的意义

世界华人消化杂志 1998年第3期第0卷 研究原著

作者：方友文¹　许国铭²　朱人敏¹　张洪富²　李兆申²

单位：1南京军区南京总医院消化内科　江苏省南京市　210002;2长海医院消化内科　上海市　200433

关键词：胰腺肿瘤/代谢；表皮生长因子-尿抑胃素；RNA，信使/代谢；印迹法，RNA

Expression of epidermal growth factor mRNA in primary pancreatic adenocarcinoma

FANG You-Wen, XU Guo-Ming, zHU Ren-Min, ZHANG Hong-Fu and LI Zhao-Shen¹Department of Gastroenterology, Chinese PLA Jinling Hospital, nanjing 210002, Jiangsu Province, China²Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Shanghai 200433, china

　　Subject headings　pancreatic neoplasms/metabolism; epidermal growth factor-urogastrone; RNA,messenger/metabolism; blotting, northern

　　abstract

　　AIM　To determine the expression of epidermal growth factor (EGF) mRNA in primary pancreatic adenocarcinoma and its relationship with the development and prognosis of the tumor.

　　METHODS　Using northern blot hybridization technic, 27 primary pancreatic adenocarcinoma tissues and 7 normal pancreatic tissues were examined for expression of EGF mRNA.

　　RESULTS　EGF mRNA was not expressed in normal pancreatic tissues, whereas 18 of 27 (66.7%) primary pancreatic adenocarcinoma tissues showed expression of EGF mRNA. statistical analysis showed that EGF mRNA expression in primary pancreatic adenocarcinoma was found to be related to lymph node metastasis (P＜0.05) and to TNM staging (P＜0.05) and that the expression was negatively with the extent of histologic differentiation (P＜0.05).

　　CONCLUSION　The expression of EGF mRNA, a possible prognostic marker of primary pancreatic adenocarcinoma, may be related to the development of primary pancreatic adenocarcinoma.

　　中国图书资料分类号　R735.9

　　摘　要

　　目的　探讨EGF mRNA的表达与胰腺癌发生、发展及预后的关系.

　　方法　应用Northern blot杂交方法，检测胰腺癌27例和正常胰组织7例中EGF mRNA表达.

　　结果　正常胰腺组织7例未检测到EGF mRNA表达，胰腺癌27例EGF mRNA阳性表达率66.7%(18例)，经卡方检验发现，EGF mRNA表达与胰腺癌病理分级、临床分期及伴随局部淋巴结转移呈显著相关(P＜0.05).

　　结论　EGF mRNA表达与胰腺癌发生有关，胰腺癌EGF mRNA表达可作为胰腺癌预后的参考指标.

　　0　引言

　　表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)是Mr6045的多肽，由53个氨基酸构成.它能刺激或抑制多种细胞的增殖与分化，在机体发育及成长过程中均起着十分重要的作用.近年研究发现，在一些恶性肿瘤细胞中，EGF有较高水平的表达^［1］，但在胰腺癌组织中，EGF mRNA表达罕见文献报道.我们应用Northern blot方法，检测胰腺癌组织中EGF mRNA表达，探讨EGF与胰腺癌生物学行为的关系.

　　1　对象和方法

　　1.1　对象　1991/1994长海医院普外科住院手术的胰腺癌患者27例，男21例，女6例，年龄31岁～75岁，平均53.7岁，诊断由手术及病理证实.正常对照胰腺7例取自意外死亡的个体解剖，取材后立即放入液氮罐中保存备用.

　　1.2 方法　①总RNA提取：取胰腺癌及正常胰腺组织1 g，应用酸酚法^［2］抽提总RNA并检查其完整性、纯度及浓度，经10 g/ L琼脂糖3 mol/ L甲醛凝胶分离，溴乙淀染色照像后，经Northern吸印转移至尼龙膜上，膜在80℃真空干燥2 h，封入塑料袋中备用.②探针的制备：含EGF cDNA的质粒PUC8经常规方法扩增，纯化后经ECORⅠ/Bam h₁酶切，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化150bp片段，经Random primer标记试剂盒(BRL)进行α-³²p-dCTP标记作探针.③Northern blot：经吸印转移好的尼龙膜在预杂交液中(50 g/ L甲酰胺，6×SSC，5×Denhart液，5 g/ L SDS，20 mg/ L变性鲑精DNA)42℃振荡2 h～3 h，加入变性之同位素标记的探针继续在42℃中震荡16 h～18 h，杂交膜经2×SSC，10 g/ L SDS室温下充分洗涤后，62℃洗涤，然后换0.2×SSC，1 g/ L SDS 62℃充分洗涤至背景放射性消失为止.用塑料袋将膜封好，压上X光片，-80℃曝光4 d后，洗片，观察结果.

　　统计学处理　采用χ²检验方法对结果进行统计学处理.

　　2　结果

　　2.1　EGF mRNA在胰腺癌组织的表达　胰腺癌组织27例，表达EGF mRNA 18例，占66.7%，表达的mRNA主要是5.0kb的分子(图1).而7例正常胰腺组织无1例表达EGF mRNA(结果未显示)，两者比较有显著差异(P＜0.05).

　　2.2 EGF mRNA表达与胰腺癌生物学行为的关系　早期胰腺癌3例，即直径≤2 cm的胰腺癌，EGF mRNA表达为阴性，而进展期胰腺癌24例，EGF mRNA表达率为66.7%(18例)，明显高于早期癌(P＜0.05).病理分级为Ⅰ，Ⅱ期者9例，EGF mRNA表达率为33.3%(3例)，而病理分级为Ⅲ，Ⅳ期者18例，EGF mRNA表达率为88.3%(15例)，两者相比较有显著意义(P＜0.05).10例无局部淋巴结转移的胰腺癌EGF mRNA阳性表达率40.0%(4例)，而17例有局部淋巴结转移的胰腺癌EGF mRNA阳性表达率82.4%(14例)，后者明显高于前者(P＜0.05)，TNM临床分期Ⅰ，Ⅱ期的10例胰腺癌EGF阳性表达率40.0%(4例)，而TNMⅢ期的17例胰腺癌临床表达82.4%(14例)，Ⅲ期EGF mRNA表达明显高于Ⅰ，Ⅱ期胰腺癌(P＜0.05)；但胰腺癌体积大小及血清中CA19-9水平与EGF mRNA表达无显著相关(P＞0.05，表1).

图1　胰腺癌组织中EGF mRNA表达

　　p: pancreatic adenocarcinoma

表1　EGF mRNA表达与胰腺癌临床特征的关系

　　3　讨论　　EGF是通过与EGFR结合导致EGFR磷酸化，引发一系列细胞内变化而发挥作用的.体外研究发现，外源性EGF可刺激一些肿瘤细胞的增殖，并且抗EGF和抗EGFR抗体可抑制其增殖，说明这些肿瘤细胞生长需要外源性EGF或其他生长因子的存在^［3］，但有些肿瘤细胞系体外培养对外源性EGF，抗EGF和抗EGFR抗体均无明显反应，这种现象很难阐明，因近年来发现很多肿瘤细胞能自分泌转化因子α(TGFα)^［4］，TGFα与EGF共同作用于EGFR，并且在恶性肿瘤的生长调节中可替代EGF而起主要作用，但这可能解释外源性EGF不起作用的原因，但尚不能解释抗EGFR抗体不起作用的原因.新近的研究发现，有些肿瘤细胞自分泌生长因子不需要分泌到细胞外，就在细胞内的某个部位激活细胞生长调节信号系统而引起细胞的增殖，由于这种分泌生长因子不分泌到细胞外，故抗EGF和抗EGFR抗体不能抑制这种通路.陈杰 et al^［3］的研究表明，一些胰腺癌细胞系存在着EGF的自分泌，并且这种细胞系中EGFR过表达，推测这种自分泌生长因子—受体的生长调节系统，可能是细胞无休止生长的原因. stern et al^［5］曾用合成的EGF基因片段转染FR3T3纤维母细胞造成细胞的无休止生长和转化. valu et al^［6］也用逆转录病毒载体将EGFR基因转染入NIH3T3细胞中，在有EGF存在的情况下形成完全转化的细胞.这些结果表明，EGF可作为自分泌的生长因子通过其细胞膜上的特异性受体而导致癌细胞的无休止生长.

　　Onda et al^［1］研究表明，许多恶性肿瘤细胞内有EGF的高表达，如EGF表达与胃癌浸润，转移与生存期呈显著相关，何双梧 et al^［7］发现EGF及EGFR表达与胃癌的恶性程度，伴随淋巴结转移及不良预后显著相关，本研究表明，胰腺癌组织中EGF mRNA表达与胰腺癌病理分级，临床分期及伴随局部淋巴结转移呈显著相关，说明胰腺癌组织EGF自分泌与胰腺癌分化程度及不良预后有关，提示EGF mRNA表达可以作为胰腺癌恶性程度及预后不良的指标.

　　方友文，男，1962-06-21生，汉族.安徽省贵池市人，1985年西安第四军医大学医疗系毕业，1996年7月在第二军医大学获消化内科医学博士学位，现任南京军区总医院消化内科主治医师，发表论文11篇.

　　通讯作者　方友文，210002，南京军区南京总医院消化内科，江苏省南京市中山东路305号.

　　Correspondence to: FANG You-Wen, Department of Gastroenterology, chinese PLA Jinling Hospital, 305 Zhongshan Donglu, Nanjing 210002, Jiangsu province, China

　　tel. +86·25·4827110-58005收稿日期　1997-11-26

　　4　参考文献

　　1　Onda m, Tokunag A, Nishi K, Yoshiyuki T, Shimizu T, Kiyama T et al. The correlation of epidermal growth factor with invasive and metastasis in human gastric cancer. jpn J Surg, 1990;20(3):269-274

　　2　Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. anal Biochem, 1987;162(1):156-159

　　3　陈杰，崔全才，顾长芳，刘彤华.上皮生长因子及其抗体对人癌细胞生长的影响.中国医学科学院学报，1992；14(4)：289-294

　　4　Liu C, Woo A, Tsao MS. Expression of TGFα in primary human colon and lung Carcinomas. Br J cancer, 1990;62(3):425-429

　　5 Stern DF, Hare DL, Cecchini MA. Construction of a novel oncogene based on synthetic sequenes encoding epidemal growth factor. Science,1987;235(4786):321-324

　　6 Velu TJ, Beguinot L, Vass WC, Zhang K, Pastan I, Lowy DR. Retroviruses expressing different levels of the normal epidermal growth factor receptors: biological properties and new bioassay. J Cell Biochem, 1989;39(2):153-166

　　7 何双梧，郭连营，李家琪. 胃癌组织中表皮生长因子及其受体的测定.中华医学杂志，1994；74(7)：413-415