胰腺癌和壶腹癌中P16蛋白及Ki-67的表达
世界华人消化杂志 1998年第5期第6卷 研究原著
作者：卜献民1 戴显伟1 马 凯1 王之章2 姜维国2
单位：中国医科大学第二临床学院 1普外一科 2病理科 辽宁省沈阳市 110003
关键词：胰腺肿瘤；胆总管肿瘤；P16蛋白；基因表达；淋巴转移；免疫组织化学
Expression of P16 protein and Ki-67 in pancreatic and ampullar cancer
BU Xian-Min1, DAI Xian-Wei1, MA Kai1, WANG Zhi-Zhang2 and JIANG Wei-Guo2
Department of Surgery, 2nd Clinical College, China Medical University, Shenyang 110003, Liaoning Province, China
Subject headings pancreatic neoplasms; common bile duct neoplasms; P16 protein; gene expression; lymphatic metastasis; immunohistochemistry
Abstract
AIM To study the expression of P16 protein and Ki-67 in pancreatic and ampullar cancer.
METHODS Thirty cases of pancreatic cancer and 30 cases of ampullar cancer specimens were obtained surgically. All samples were fixed with formalin, embedded with paraffin and sectioned serially. HE method was applied to test the differentiation degrees and lymph node metastasis. The expression of P16 protein and Ki-67 was detected by immunohistochemical method (S-P method).
RESULTS The frequency of P16 protein deletion was 56.7% and 46.7% respectively in both kinds of tumors. The frequency of deletion varied statistically with different degrees of differentiation. The positive rate of Ki-67 was 50.0% and 36.7% respectively, its expression was related to the lymph node metastasis. The expression of P16 protein and Ki-67 showed difference in two kinds of cancers, but without statistical significance.
CONCLUSION Expression of P16 protein and Ki-67 may help with adjuvant diagnosis, and evaluate prognosis, but can not be used to differentiate pancreatic cancer from ampullar cancer.
中国图书资料分类号 R735.9
摘 要
目的 研究P16蛋白及Ki-67抗原在胰腺癌和壶腹癌中的表达及生物学意义.
方法 对30例胰腺癌和30例壶腹癌手术标本进行常规组织学处理，石蜡包埋，连续切片，HE染色确定其分化程度及有无淋巴结转移，用免疫组化S-P法检测了P16蛋白和Ki-67的表达情况.
结果 在两种肿瘤中，P16的表示缺失率分别为56.7%和46.7%，随着肿瘤的分化程度不同，其缺失率也有显著差异；Ki-67在两组肿瘤中的表达率分别为50.0%和36.7%，其表达和是否有淋巴结的转移有明显的关系. 两种基因的表达在两组肿瘤中均无明显统计学差异.
结论 检测P16蛋白和Ki-67在胰腺癌和壶腹癌中的表达，可以为辅助诊断及估计预后提供帮助，但是不能用来鉴别胰腺癌还是壶腹癌.
0 引言
胰腺癌恶性度极高，近年来发病率明显提高，预后极差. 和胰头癌部位相近的壶腹癌，其5?a生存率明显高于胰头癌. 我们利用免疫组化方法观察了P16蛋白和Ki-67在胰腺癌和壶腹癌中的表达，以探讨二者在辅助诊断，估计预后以及鉴别诊断中的作用，结果如下：
1 材料和方法
1.1 材料 胰腺癌手术标本30例，均为胰头癌；壶腹癌标本30例(表1). 经100mL/L中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成5μm厚的连续切片，每例切片均作HE染色和免疫组化染色. 兔抗P16多克隆抗体(RAb-0223)和鼠抗Ki-67单克隆抗体(mAb-0149)均为Zymed公司产品，S-P试剂盒(kit-9320)为Maxin公司产品.
1.2 方法 本实验采用免疫组化链菌素亲生物素-过氧化物酶法(S-P法). 结果判断标准：P16染色判断以细胞质呈清晰红色为阳性判断标准. 根据着色深度分为：强阳性++，呈深红色；弱阳性+；呈淡红色；以细胞质无红色或与背景颜色一致为阴性. Ki-67的染色结果用标记指数表示，标记指数(LI)=(Ki-67阳性细胞数/计数细胞数)×100%. 每例切片在阳性分布区选10个高倍视野以计数，统计结果时分为LI≥10%，LI＜10%和LI=0三级. 数据处理采用χ2检验，秩和检验.
表1 胰腺癌和壶腹癌的一般临床资料
| 诊断 |
n |
男 |
女 |
平均年龄
(岁) |
分化程度 |
淋巴结
转移 |
| 高 |
中 |
低 |
| 胰腺癌 |
30 |
18 |
12 |
61 |
11 |
17 |
2 |
4 |
| 壶腹癌 |
30 |
17 |
13 |
54 |
16 |
13 |
1 |
0 |
2 结果
2.1 P16蛋白的表达 在胰腺癌中(图1，2)，有17例P16蛋白表达缺失，在高、中、低分化肿瘤中缺失率分别为27.3%，70.6%和100%(表2). 在壶腹癌中(图3)，有15例P16蛋白表达缺失，高、中、低分化肿瘤中的缺失率分别为31.3%，61.5%和100%(表2). 因低分化肿瘤数目较少，故将高、中分化肿瘤中的P16蛋白缺失率进行统计学分析，得出P＜0.05，P16蛋白在两组肿瘤中的缺失率分别为56.7%和46.7%，经χ2检验P＞0.05.
在胰腺癌中，有4例病理证实有淋巴结转移，其中1例P16蛋白表达为++，2例表达为+，1例表达为-，说明P16蛋白的表达和淋巴结转移无明显关系.
低年龄患者中P16蛋白表达的缺失率较高，在≤50岁组中分别为87.5%(7/?8)和66.6%(8/?12)，在＞50岁年龄组中为45.5%(9/?22)和33.3%(6/?18).
表2 P16蛋白在胰腺癌和壶腹癌中的表达
| 诊断 |
|
P16的表达 |
缺失率
(%) |
| ++ |
+ |
- |
合计 |
| 胰腺癌 |
高分化 |
5 |
3 |
3 |
11 |
27.3a |
| |
中分化 |
1 |
4 |
12 |
17 |
70.6 |
| |
低分化 |
0 |
0 |
2 |
2 |
100.0 |
| 壶腹癌 |
高分化 |
6 |
3 |
7 |
16 |
31.3a |
| |
中分化 |
2 |
3 |
8 |
13 |
61.5 |
| |
低分化 |
0 |
0 |
1 |
1 |
100.0 |
aP＜0.05, vs 中分化，秩和检验.2.2 Ki-67的表达 在各种分化程度不同的肿瘤中均有Ki-67的表达(图4，5)，无论是在胰腺癌还是在壶腹癌中，其表达在不同分化程度的肿瘤中均无显著性差异(P＞0.05). Ki-67的表达在胰腺癌和壶腹癌中的阳性率分别为50.0%和36.7%，经χ2检验P＞0.05(表3). 在4例有淋巴结转移的胰腺癌组织中，Ki-67都呈阳性表达，且其中有3例LI指数＞10%，虽因样本数小，未行统计学分析，但亦提示Ki-67的表达和淋巴结转移有一定关系.
图1 胰腺癌S-P染色P16 及Ki-67阴性表达 100×
2 胰腺癌S-P染色P16阳性表达 100×
3 壶腹癌S-P染色P16阳性表达 400×
4 胰腺癌S-P染色Ki-67阳性表达 100×
5 壶腹癌S-P染色Ki-67阳性表达 100×
表3 Ki-67在胰腺癌和壶腹癌中的表达
| 诊断 |
|
Ki-67的表达 |
阳性率
(%) |
| LI≥10% |
LI＜10% |
LI=0 |
合计 |
| 胰腺癌 |
高分化 |
3 |
2 |
6 |
11 |
45.5a |
|
|
中分化 |
5 |
4 |
8 |
17 |
52.9 |
| |
低分化 |
0 |
1 |
1 |
2 |
50.0 |
| 壶腹癌 |
高分化 |
2 |
4 |
10 |
16 |
37.5a |
| |
中分化 |
3 |
2 |
8 |
13 |
38.4 |
| |
低分化 |
0 |
1 |
0 |
1 |
0.0 |
aP＞0.05, vs 中分化，秩和检验.3 讨论
多种肿瘤抑制基因(MST1)，是1994年发现的抑癌基因，它是周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)抑制因子. 而细胞进入分裂周期依赖于周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的活化，而MTS1/CDKN2p16基因通过其编码蛋白P16蛋白特异性地作用于CDK4，阻断CDK-cyclin D复合体对Rb蛋白的磷酸化作用，使得Rb对E2F等转录因子的结合力增强，使细胞不能从G1期进入S期，从而起到抑制细胞增生和恶性转化的作用. 现已证明p16基因突变及缺失广泛存在于多种恶性肿瘤中［1］，包括神经胶质瘤，白血病，肺癌，膀胱癌等，国外文献报道，p16在胰腺癌中的突变和同源缺失约为80%［2］. 我们应用免疫组化方法研究了人胰腺癌及壶腹癌中P16蛋白的表达情况，证实了P16蛋白在两种肿瘤中均有不同程度的表达，其表达染色定位于细胞质内，细胞核不染色，并且在不同分化程度的肿瘤中缺失率有明显差异，肿瘤的分化程度越低，其缺失率越高，所以P16蛋白的表达可以反映肿瘤的恶性程度. 它可以和病理诊断同时进行，从而提供一种辅助诊断的方法，并且为估计患者的预后提供帮助.
年龄是胰腺癌发病的一个重要因素，在40岁～44岁年龄组的发病率为2/?10万，到80岁～84岁年龄组则达100/?10万，大约增长50倍［3］. 我们发现在低年龄组中P16蛋白的缺失率明显大于高年龄组，但因样本较小，尚不能对此下明确结论. 本结果提示，在胰腺癌低年龄组患者中，p16基因的缺失可能是重要因素，这为今后研究胰腺癌的发病机制提供了新的思路，并使今后的特异性基因治疗具有更强的针对性.
Ki-67是由Mr 345 000和395 000的两条多肽链组成的核蛋白，其表达根据细胞周期而异. 以往的研究表明，Ki-67可以体现细胞的增生活性，为疾病的活动提供客观指标. 本实验表明，Ki-67在胰腺癌及壶腹癌中均有一定程度的表达，其染色部位在细胞核，说明在胰腺癌和壶腹癌中肿瘤细胞呈现过度增生，在不同分化程度的肿瘤中，Ki-67的表达没有明显差异，这和以往的研究结果有所不同［4］，分析其原因可能有：①样数较小，未能反映出二者之间的关系； ②Ki-67的表达和肿瘤的分化程度之间没有明确的关系. 在有淋巴结转移的癌组织中，Ki-67呈现明显的高表达，已有的研究表明，胰腺癌是否有淋巴结转移是决定其5?a生存率的最重要因素，Cameron et al［5］对82例胰头癌行胰十二指肠切除术后进行随访，其中25例无淋巴结转移的患者，5?a生存率为57%，其余57例有淋巴结转移的，5?a生存率＜5%. 所以，Ki-67表达不仅能反映肿瘤的增生活性，反映肿瘤的生物学行为，并且为估计肿瘤的预后提供客观指标. 本实验还表明，P16蛋白和Ki-67在两种肿瘤中均有一定程度的表达，且无论是P16蛋白的缺失还是Ki-67的阳性表达，胰腺癌均高于壶腹癌，尤其是Ki-67的阳性率，但二者之间没有明显的统计学意义，这说明P16的高缺失率和Ki-67的高表达率，尤其是后者可能是胰腺癌比壶腹癌预后差的原因，但不是决定性因素，这两种基因的表达不能用来鉴别胰腺癌还是壶腹癌.
4 参考文献
1 Nobori T, Miura K, Wu DJ, Lois A, Takabayashi K, Carson D. Deletions of the cyclin-Dependent kinase 4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature, 1994;368(6473):753-756
2 Hahn SA, Kern SE. Molecular genetics of exocrine pancreatic neoplasm. Surg Clin North Am, 1995;75(5):857-869
3 Lillemoe KD. Pancreatic disease in the elderly patient. Surg Clin North Am, 1994;74(2):317-344
4 吴育连，范敏明，顾才校. 胰腺癌的Ki-67抗原表达. 中华实验外科杂志，1996；13(5)：265-266
5 Cameron JL, Crist DW, Sitzman JV, Hruban RH, Boitnott JK, Seidler AJ et al. Factors influencing survival following pancreatioduodenectomy for pancreatic cancer. Am J Surg, 1991;161(1):120-125
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卜献民，男，1972-08-23生，辽宁省营口市人，汉族. 1997年中国医科大学七年制临床医学系毕业，外科医师.
通讯作者 卜献民，110003，中国医科大学第二临床学院普外一科，辽宁省沈阳市和平区三好街36号.
Correspondence to:BU Xian-Min, Department of Surgery, 2nd Clinical College, China Medical University, 36 Shanhaojie, Heping District, Shenyang 110003, Liaoning Province, China
Tel. +86*24*3893501-512
收稿日期 1998-01-05 修回日期 1998-03-06
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