EB病毒DNA聚合酶基因的表达与纯化及其在鼻咽癌病人诊断中的应用

病毒学报 2000年第3期第16卷 病毒学诊断

作者：唐慰萍　黄滨　李伯军　周为民　皮国华　谷淑燕

单位：唐慰萍（广东医学院病理教研室　湛江　524023）；黄滨　李伯军　周为民　皮国华　谷淑燕（中国预防医学科学院病毒学研究所　北京 100052）

关键词：EB病毒；DNA聚合酶；诊断；鼻咽癌

　　摘要　以Epstein－Barr病毒（EBV）DNA聚合酶为抗原，建立了简便、快速、敏感和特异的鼻咽癌诊断方法。构建原核表达载体pRSET－DNA聚合酶及其亚克隆pRSET－A1和pRSET－A2，在BL21（DE3）中表达的产物，经Western－blot检测其抗原性并用于检测鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）病人血清中的抗体。在NPC病人血清中存在抗EB病毒DNA聚合酶的IgG抗体，并证明DNA聚合酶的抗原性主要集中于后2／3片段（A2）上。Western－bolt检测A2／IgG抗体的敏感性和特异性分别为80％和100％。对46份NPC病人血清和46份非NPC头颈癌症病人血清，用ELISA检测A2／IgA，敏感度为89％，特异度为93％。初步建立了ELISA检测NPC病人血清中A2／IgG抗体的方法，获得较高的敏感性和特异性。

　　中图分类号：R373；R739.63　　　文献标识码：A

　　文章编号：1000－8721（2000）03-0258-04

Study on the Expression and Purification of Epstein-Barr Virus DNA

　　Polymerase and Its Application to Diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma

HUANG Bin，LI bo-jun，ZHOU Wei-min，PI Guo-hua，TANG Wei-ping，GU Shu-yan（Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China）

　　Abstract: In order to establish a simple, rapid, sensitive and specific assay for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC), we prepard Epstein-Barr virus (EBV) DNA polymerase antigen by genetic engineering. DNA polymerase was expressed in BL21(DE3) using pRSET vector. The expressed product was characterized by SDS-PAGE and Western-blot. The IgG antibody angainst DNA polymerase of EBV in sera of NPC patients can be testified by expressed DNA polymerase through Western-blot and ELISA. The DNA polymerase is divided into the front 1/3 and the last 2/3 A2 parts, on A2 the antigenicity of DNA ploymerase locates. The sensitivity and specificity of Western-blot for detecting A2/IgG antibody was 80% and 100% respectively. The ELISA test established to detect A2/IgG antibody in sera of 46 NPC patients and 46 non-NPC patients also showed high sensitivity (89%) and specificity (93%).

　　Key words: Epstein-Barr virus; DNA polymerase; diagnosis; nasopharyngeal carcinoma

　　EB病毒与鼻咽癌（NPC）关系密切^［1］。通过检测EB病毒抗体以早期诊断NPC是提高NPC病人存活率的重要手段^［2］。用基因工程手段表达和纯化的蛋白和多肽为抗原，建立简便、快速、灵敏、特异的诊断方法，是目前NPC诊断的主要发展方向。例如DNA聚合酶，是由EB病毒BamHI A片段左向的第五个阅读框编码（BALF5），基因大小为3kb，编码蛋白的分子量约110kD，是EB病毒DNA复制的关键性酶。DNA聚合酶的诊断意义已被Liu^［3］等以酶中和反应证明，高滴度的EB病毒DNA聚合酶IgG抗体，早在Ⅰ期NPC病人血清中被检测到。我们采用基因重组技术在大肠杆菌表达DNA聚合酶全基因及部份基因，用纯化的表达产物作为抗原检测NPC病人血清中抗体，建立了敏感、特异的诊断方法。

　　材料与方法

　　1　质粒和菌株　质粒pRTS－21含有DNA聚合酶全基因，由王轶龙惠赠。pRSET－b、pRSET－a原核表达载体由我所肝炎室惠赠，为T7启动子控制下的融合蛋白原核表达载体。在融合蛋白的N末端含有6个连续的组氨酸标签。菌株BL21（DE3）为该载体的表达宿主菌。

　　2　NPC病人、头颈部非NPC病人和正常人的血清　均由广东医学院病理教研室提供。

　　3　其它试剂　限制性内切酶和T4连接酶均购自New England Biolabs公司。Taq酶购自六合通公司。DNA回收试剂盒QIAXⅡ购自QIAGEN公司。

　　4　DNA聚合酶基因的PCR扩增　根据DNA聚合酶基因序列设计PCR扩增的上下游引物。上游引物：5＇CGGAATTCATGTCTGGGGGACTCTTCTATAAC3＇；下游引物为：5＇CCCAAGCTTTTAGAATGGTGGCCGCGCTGTTAA3＇。以pRTS21质粒为模板做PCR扩增DNA聚合酶基因。PCR扩增过程：94℃变性2min，然后94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，最后一个循环94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 5min。PCR产物以酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，晾干后用去离子水溶解。

　　5　IFA方法检测VCA／IgA、EA／IgA　具体操作方法见参考文献^［4］。

　　6　Western－blot方法　具体操作方法见参考文献^［5］

　　7　重组蛋白的表达与纯化　将含有重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）接种于Amp^＋的LB培养基中，37℃振荡至OD₆₀₀达1的时候，加入IPTG至终浓度1mmol／L，继续培养5h，4℃　5 000r／min离心15min收获细菌。超声裂解细菌，用4mol／L尿素洗涤包涵体，8mol／L尿素溶解包涵体。以Ni^2＋亲和层析，按Pharmacia Chelating Sepharose Fast Flow使用手册所述方法纯化蛋白。

　　8　ELISA　以纯化后的蛋白按50ng／孔包被ELISA板，4℃过夜，用洗涤液（PBS 0.1mol／L pH7.4，0.05％Tween20）洗涤2次，封闭液为含10％牛血清的PBS，37℃湿盒孵育2h，洗涤3次，每孔加1∶100稀释的血清100μl，37℃湿盒卵育1h，洗涤3次，每孔加入100μl 1∶1000稀释的抗人IgG酶标抗体，37℃湿盒孵育1h，洗涤3次，TMB底物显色，4mol／L H₂SO₄终止反应，于酶标仪上测定其450nm处的吸光值，结果测定以OD值＝（OD值－空白孔OD值）／（阴性孔值－空白孔值）≥1.5为阳性。

　　结　　果

　　1　DNA聚合酶基因的扩增及重组表达载体的构建

　　扩增后的DNA聚合酶的PCR产物与不加模板DNA的阴性对照进行琼脂糖电泳。聚合酶PCR产物在3kb左右有一条扩增条带。片段大小与DNA聚合酶基因相符（图1）。将DNA聚合酶全基因PCR扩增产物以Eco RⅠ与HindⅢ酶切后，插入pRSET－b上相应的酶切位点，转化大肠杆菌JM109，挑选重点克隆经酶切鉴定（图2）。构建成的pRSET－DNA聚合酶（pRSET－A）以EcoRⅠ SalⅠ酶切后纯化回收1kb片段的前1／3，插入pBV220载体构建pBV－A1（DNA聚合酶前1／3部分）过渡载体，再以EcoRⅠ和HindⅢ酶切pBV－A1，回收1kb的前1／3片段，插入pRSET－b载体构建成pRSET－A1表达载体。以XhoⅠ和HindⅢ酶切pRSET－A，纯化回收2kb的DNA聚合酶的后2／3片段，插入pRSET－a载体，构建pRSET－A2（DNA聚合酶后2／3部分）表达载体。

图1　PCR扩增DNA聚合酶基因1％

　　琼脂糖凝胶电泳结果

　　Figure 1　1％ agarose gel electrophoresis of DNA polymerase gene amplified by PCR

　　1.PCR product；2.Negative control；3.λDNA／HindⅢ marker.

　　2　pRSET－DNA聚合酶，表达及特异性

　　将重组质粒转化BL－21（DE3）细菌，挑选单克隆，接种5ml含Amp的LB培养液，猛烈振荡至OD₆₀₀为1，此时加入IPTG（1mmol／L）诱导4h，将诱导前与诱导后4h的菌样空载体对照进行SDS－PAGE。pRSET－A在诱导后于110kD左右出现一条表达带，分子量与DNA聚合酶相近（图3）；pRSET－A1在30kD处出现一条新的表达带，分子量与pRSET－A1（DNA聚合酶前1／3部分）相近；pRSET－A2在70kD处出现一条新的表达带，分子量与pRSET－A2（DNA聚合酶2／3部分）相近（图4）。将IPTG诱导后的含pRSET－A和A2经SDS－PAGE和Western－blot分析，结果表明，pRSET－A与NPC病人血清孵育出现一条明显条带，A1无明显阳性条带出现。说明DNA聚合酶的抗原特异性，并且后2／3部分具有足够强的反应特异性。

图2　pRSET－A重组质粒构建及酶切图谱

　　Figure 2　Restriction map of recombinant plasmid pRSET－DNA polymerase

　　1.λDNA/HindⅢ marker； 2.pRSET； 3.HindⅢ； 4.EcoRⅠ； 5.HindⅢ＋EcoRⅠ； 6.BamHⅠ＋HindⅢ； 7.BamHⅠ； 8.SmaⅠ； 9.PstⅠ； 10.SalⅠ； 11.XhoⅠ.

图3　A₂的重组质粒表达产物检测及纯化

　　Figure 3　Identification and purification of the expressed product of pRSET－A₂ recombinant plasmid

　　1.pRSET induced； 2.pRSET－A₂ uninduced； 3.pRSET－A2 induced； 4.Supernatant of lysis； 5.Supernatant of 4mol／L urea； 6.Supernatant of 8mol／L urea； 7. The purified protein.

　　3　A2的纯化

　　pRSET－A2的表达产物经不同浓度的尿素洗涤后，溶于8mol／L尿素。经蛋白扫描纯度可达80.4％，经Ni^2＋亲和层析纯化后蛋白扫描，纯度可达96.1％（图4）。

　　4　检测NPC病人和非NPC头颈部癌症病人血清中的抗体

　　纯化后的A2蛋白20μg，经SDS－PAGE后转印到硝酸纤维膜上，裁成20个小条，分别与1∶100稀释的NPC病人血清与非NPC头颈部癌症病人血清孵育，检测A2／IgG抗体。结果10份NPC血清中有8份血清出现明显的阳性条带，10份对照血清无一例阳性。特异性为100％。

图4　DNA聚合酶的Western blot分析

　　Figure 4　Western blot analysis of recombinant protein

　　expressed by pRSET－A2

　　a.The result of NPC serum； b.The result of control serum.

　　1，3. The expression of pRSET－A2；2，4.The expression of pRSET control.

　　5　ELISA检测NPC病人血清中的A2／IgG

　　46份NPC病人与46份非NPC头颈部癌症病人血清，用ELISA检测A2／IgG，并与检测VCA／IgA和EA／IgA作比较，结果ELISA检测A2／IgG的敏感度为89％，特异度为93％（表1）。

表1　ELISA检测A2／IgG的结果

Table 1　A2／IgG detection by ELISA

　　Cutoff value＝0.094×2.1＝0.198；＋. OD₄₅₀≥0.198.

讨　　论

　　本研究的目的是将EB病毒的DNA聚合酶基因克隆到pRSET－A原核表达载体上，并在BL21（DE3）细菌中获得表达。通过分别与NPC病人血清与正常人血清的Western－blot IgG抗体分析，证明了表达产物的特异性，同时也表明在NPC病人血清中存在着针对EB病毒DNA聚合酶的IgG抗体。由于DNA聚合酶的片段长达3kb，而大肠杆菌表达片段的适合大小为1kb以内，因此DNA聚合酶全基因在大肠杆菌中的表达量较低（5％），因此构建了pRSET－A1和pRSET－A2载体，分别表达DNA聚合酶的前1／3片段和后2／3片段。经蛋白扫描检测表达量分别为75％与33％。经Western－blot分析，DNA聚合酶抗原特异性主要存在于其后2／3片段。将纯化后的A2抗原检测10份NPC病人与非NPC头颈部癌症病人血清中的IgG抗体，其中8份NPC血清呈阳性，对2例漏检的血清增加膜的抗原量（100μg）或降低血清稀释度（1∶20），均可呈阳性反映，表明A2／IgG检测在NPC诊断中具有良好的应用前景。用纯化的A2抗原初步建立ELISA方法，检测了46份NPC和46份非NPC头颈部癌症病人血清中的IgG抗体，敏感性达89％，特异性达93％。综合敏感性与特异性ELISA检测A2／IgG优于传统的IFA VCA／IgA抗体检测，在46例非NPC病人血清中32例阳性，ELISA检测A2／IgG有可能成为代替传统的IFA检测的较好方法。

　　作者简介：黄滨（1971－），男，医学硕士，研究方向：微生物学。

　　参考文献：

　　［1］Kieff E. Epstein-Barr virus： increasing evidence of a link to carcinoma ［J］. New Eng J Med, 1995, 33: 724-726.

　　［2］Henle L, Henle W. Epstein-Barr virus specific IgA serum antibodies as an outstanding feature of nasopharyngeal carcinoma ［J］. Inter J Lancet, 1976, 17:1-17.

　　［3］Liu M Y, Chou W H, Nutter L. Antibody against Epstein-Barr virus DNA polymerase activity in sera of patients with nasopharyngeal carcinoma ［J］. J Med Virol, 1989, 28:101-105.

　　［4］黄桢祥，洪涛，刘崇柏.医学病毒学基础及实验技术［M］.北京：科学出版社，1990，216-218.

　　［5］Hsu T Y, Pai C Y, Sheih S M. Use of antigen expressed in bacteria for detection of EBV specific thymidine kinase antibodies in sera from patients with nasopharyngeal carcinoma ［J］. J Med Virol, 1992, 38:214-219.

收稿日期：2000－02－28；修回日期：2000－04－16