用基因工程表达的抗原早期诊断鼻咽癌

中华实验和临床病毒学杂志 1998年第1期第0卷 病毒诊断

作者：万卓越　皮国华　孙宁　李志仁　唐慰萍　谷淑燕

单位：150036　哈尔滨　黑龙江省卫生防疫站(万卓越　李志仁)；中国预防医学科学院病毒学研究所(皮国华 谷淑燕)；广东医学院病理教研室(孙宁　唐慰萍)

　　关键词: 鼻咽肿瘤/病毒学；基因工程抗原；酶联免疫吸附测定

　　【摘要】　目的　为了建立鼻咽癌(NPC)早期诊断方法。方法　以基因工程表达的、经纯化的EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)早期抗原(EA)成分EA-D和EA-R作为诊断抗原，建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)，检查30例NPC病人及49例正常人血清中的EA/IgA抗体。结果　用ELISA检测抗体较用细胞涂片免疫酶方法(IE)敏感。ELISA检测NPC病人血清中EA/lgA抗体，阳性率为100%，EA/lgA抗体效价均≥1∶100。而用IE法，平行检测30例NPC病人血清中EA/lgA抗体效价，结果6例为阴性(＜1∶10)，抗体阳性率为70%。ELISA明显地提高了NPC的检出率。以p138(EA-R)和p54(EA-D)分别或混合包被，检测对EBV特异的EA-D和EA-R的抗体。结论　表明在NPC病人血清中存在对EA两种抗原的抗体，对EA-D的抗体滴度高于对EA-R的抗体。因此，以两种抗原混合包被作为诊断抗原建立的ELISA方法，为NPC的早期诊断提供更敏感、特异和简便的手段。

Early diagnosis of nasopharyngeal carcinoma using recombinant antigens expressed in bacterial

Wan Zhuoyue, Pi Guohua Sun Ning, et al. The Epidemic Prevention Station of Heilongjiang Province　150036

　　Abstract　An enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) was developed by using recombinant purified early antigens, EA-D and EA-R to detect lgA antibodies in sera from nasopharyngeal carcinoma(NPC)pateints. 30 sera from NPC pateints and 49 sera from normal persons were detected by the developed ELISA. The serum positive rate and antibody titer were compared with immunoenzymatic method(IE)on slide with Raji cells Smears. ELISA is more sensitive and specific. The serum positive rate of NPC patients was increased from 70% by IE to 100% by ELISA and 77% of the serum antibody titer reached≥1∶200. The results show that the expressed recombinant p138 and p54 antigens are effective for detection of EA/IgA antibody in sera from NPC patients and ELISA will be a sensitive, specific and convenient method for early diagnosis of NPC.

　　Key words:　Nasopharyngeal carcinoma　　Recombinant antigens　　Emzyme-linked immunosorbent assay

　　EB病毒(EBV)是对人类致病的疱疹病毒，很多研究证明EBV与鼻咽癌(NPC)的发生密切相关。在我国南方数省NPC的发病率和死亡率均占恶性肿瘤的第一位。早期诊断和早期治疗能使70%以上的肿瘤病人得到完全控制。在临床上和前瞻性血清流行病学调查中，用血清学检测EBV特异性抗体，是早期发现NPC病人的重要手段。常用的血清学诊断方法是用免疫荧光(IF)或免疫酶(IE)方法，以带有EBV基因组的淋巴母细胞株B95-8细胞或Raji细胞涂片检查人血清中对EBV壳抗原(VCA)和早期抗原(EA)的lgA抗体^（1，2） 。IF或IE方法以固定的细胞作为抗原的来源，在显微镜下逐一判断结果，方法繁琐，而且在带有EBV基因组的细胞中存在多种特异的或非特异的抗原成分，影响了检测方法的特异性和敏感性。很多研究者试探建立ELISA检测人血清中对EBV相关抗原的抗体，较细胞涂片方法简便、敏感^（3，4）。但是，从自然表达抗原的淋巴细胞中提取抗原的量极低，限制了ELISA的应用。我们用基因工程技术表达的EA-D(P54)和EA-R(p138)作为诊断抗原，建立了敏感、特异的ELISA，用来检测血清中EA/lgA抗体，为血清学诊断建立一个有效的方法。

　　1　材料和方法

　　1.1　抗原和血清　基因工程表达的EA-D(P54)EA-R(p138)抗原由谷淑燕教授提供，NPC病人血清及现场普查人群血清由广东医学院病理教研室提供。正常人血清购自北京血站。

　　1.2　试剂　过氧化物酶标记的抗人lgA抗体(A-7073)、TMB及过氧化氢均购自sigma公司。

　　1.3　ELISA操作过程　以EA-D和EA-R抗原包被ELISA板(NUCK)，包被液为Tris缓冲溶液(50mmol/L Tris,100mmol/L NaCl, pH 7.5)，每孔50ng/100μl，4℃过夜包被。封闭液为含2%BSA的10mmol/L PBS(pH7.4)4℃过夜封闭或37℃封闭2小时。待检血清用样品稀释液(10mmol/L PBS, pH7.2-7.4含10%灭活小牛血清)进行1∶100稀释，每孔加待检血清100μl，43℃孵育30分钟，用PBS(0.5% Tween-20,10mmol/L PBS, pH7.2-7.4)洗板5次，加抗人lgA酶标抗体43℃孵育30分钟，洗板后显色。以滴瓶分别滴加1滴(约50μl)底物液A和B(每升100mmol/L柠檬酸缓冲溶液pH7.0分别含TMB 100mg或H₂O₂ 1ml)37℃反应10-15分钟，以1滴2mol/L H₂SO₄终止反应。在酶标仪上以波长450nm测量A值。同时做阳性和阴性血清对照。阳性对血清A值为1.0以上，阴性对照血清A≤0.05，cut-off值为阴性对照血清平均值×2.1。待检血清A值≥cut-off值为EBV EA/lgA抗体阳性。

　　2　结果

　　以方阵滴定方法确定包被量。从每孔200μg至12.5μg连续倍比稀释，从100μg-25μg包被的抗原量对检测血清抗体效价无明显差别，本实验选择50μg/孔包被，用以检查不同人群血清中的EA/lgA抗体。NPC病人和正常血清中EA/lgA抗体阳性率和效价见表1和图1。待检血清1∶100稀释，30例NPC病人血清均阳性，大多数病例其A值在1.0以上，其中2例A值达3.0。按3.0计算，平均值1.67。49例正常人血清中的48例A值小于0.05，仅1例为0.2。用IE和ELISA平行检测30例NPC病人血清中EA/lgA抗体效价，与在细胞涂片上用免疫酶法检查的结果基本平行，但ELISA方法更敏感。用细胞涂片IE法检查的30例NPC病人血清，其中6例EA/lgA抗体阴性，即血清稀释度低于1∶10，阴性占20%(6/30)，≤1∶10为13例，阳性率80%(24/30)。用ELISA平行检查，当待检血清作1∶100稀释时，30例NPC病人血清均呈阳性，≥1∶200占77%，明显地提高了NPC的检出率。

表1　NPC病人和正常人血清中EA/lgA抗体

　　Tab.1　The EA/lgA antibody in sera from NPC patients and normal persons

　　* 不同的血清，A值分别为0.27和0.21* Different serum with low A value (0.27 and 0.21)

图1　NPC病人血清中EA/IgA抗体分布

　　fig. 1　The EA/IgA antibody titer in sera from NPC Patients

　　用p138和p54分别包被酶标板，检测血清中相对应的EA/lgA抗体，当血清1∶100稀释时，30例NPC病人血清均呈阳性，其A值基本平行，对p54抗原的抗体略高。以p138和p54混合包被，其A值大于单个的抗原包被。用ELISA检查经免疫酶细胞涂片方法确定的VCA/lgA阳性和阴性的非NPC病人血清各40例。其中一例VCA/lgA(1∶320)和EA/lgA(1∶10)抗体阳性的血清，在ELISA检测中该份血清阳性，临床检查证明为NPC。其余79份血清为阴性。3　讨论

　　在NPC的血清学诊断中，多年来大量现场研究和临床检查证明，检测血清中对EBV的EA/lgA抗体，被认为是诊断NPC的特异性标志。在我国广西不同地区现场普查中EA/lgA抗体阳性者，VCA/lgA抗体均阳性。但是，EA/lgA抗体阳性者中NPC的检出率占30%以上，而VCA/lgA抗体阳性者中NPC的检出率小于2%，表明检测血清中EA/lgA抗体更有效^〔5〕。但是，用细胞涂片作为EA的来源检查相应的抗体，其方法不够敏感，NPC病人血清抗体阳性率仅为70%左右，经SPA处理血清，降低血清中lgG成分，使NPC病人血清EA/lgA抗体阳性率提高到90%^〔6〕。由于操作方法繁琐，限制了应用。Uen等^〔3〕从经过TPA激活的Raji细胞中提取EA，用ELISA检测NPC病人血清中的EA/lgA抗体，获得很好的特异性和敏感性。受提取方法和提取量的限制，不能实际应用。因此，提出了用基因工程手段表达特异性诊断抗原的重要性^〔7〕。EBV-EA复合物中包括EA-D和EA-R。我们以基因工程表达，纯化的EA-D和EA-R作为诊断抗原，建立了ELISA检测特异性抗体，其目的是研究p138和p54在NPC诊断中的意义。研究结果表明，NPC病人血清中存在对EA-D和EA-RD的抗体，对EA-D的抗体效价及A值高于对EA-R的抗体。因此，在进一步的ELISA检测抗体时使用混合抗原。

　　1997年8月26日收稿　12月12日修回

　　参　考　文　献

　　1　Henle G, Henle W. Epstein-Barr virus specific lgA antibodies as an outstanding feature of nasopharyngeal carcinoma. lnt J Cancer, 1996,17:1-7.

　　2　Zeng Y. Seroepidemiological studies an nasopharyngeal carcinoma in China. Adv Cancer Res, 1985,44:121-138.

　　3　Uen W C, Luka J, Pearson G R. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)for detecting lgA antibodies to the Epstein-Barr virus. lnt J Cancer,1988,41:479-482.

　　4　Dolken G, Weitzmann V, Boldt C, et al. Detection of lgA antibodies to Epstein-Barr virus-assocciated antigens by ELISA. J lmmunol Methods. 1984,68:331-339.

　　5　曾毅，张芦光，吴映成，等.广西梧州市EB病毒lgA/VCA抗体阳性者的追踪观察。病毒学报，1985，1：7-11.

　　6　皮国华，曾毅，叶树清，等.用改进的测定Epstein-Barr病毒早期抗原lgA的方法为2054人检查鼻咽癌.病毒学报，1987，3：236-238.

　　7　Luka J, Chase R C, Pearson G R, et al. A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)against the major EBV-associated antigens. l, Correlations between ELISA and immunofluorecence titers using purified antigens. J lmmunol Methods. 1984,67:146-156.

　　8　Pearson G R, Luka J, Pett L, et al. ldentification of an Epstein-Barr virus early gene encoding a second component of the restricted early antigen complex. J Virol, 1987,160:151-161.