鼻咽癌细胞株SUNE1中EB病毒LMP1全基因克隆及部分序列的测定

中华实验和临床病毒学杂志 1999年第3期第13卷 论著

作者：陈元　郭辉玉　曹虹　汪慧民

单位：陈元　郭辉玉　(510089　广州　中山医科大学微生物学教研室)；曹虹　(第一军医大学微生物学教研室)；汪慧民　(中山医科大学肿瘤医院)

　　关键词: Epstein-Barr病毒；鼻咽癌；潜伏膜蛋白1基因；DNA测序

　　【摘要】　目的　研究广东地区鼻咽癌(NPC)细胞株SUNE1中EB病毒LMP1基因的结构特征。方法　利用聚合酶链反应从SUNE1细胞基因组中扩增LMP1全长DNA，并克隆到pcDNA3载体中，采用Sanger双脱氧末端终止法测定SUNE1-LMP1 3个外显子及2个内含子覆盖的序列，并与病毒原型B95-8-LMP1进行比较分析。结果　克隆到pcDNA3中的SUNE1-LMP1全基因长度为2.6 kb，测序长度为1 312 bp，与B95-8-LMP1比较，核苷酸与氨基酸的同源性分别为98.5%和96%，核苷酸及氨基酸变异主要在第3外显子，但无C端343～352密码子30个碱基的缺失，第1外显子上有XhoⅠ酶切位点的丢失。结论　广东地区NPC细胞株SUNE1中，病毒LMP1基因与原型株之间尽管致瘤性存在差异，但仍具有较高的同源性。提示NPC细胞中LMP1的致瘤特征可能并非由于LMP1基因某些特定核苷酸突变所致。

DNA cloning and partial sequence analysis of EBV LMP1 gene isolated from human nasopharyngeal carcinoma cell line SUNE1

CHEN Yuan^*, GUO Huiyu, CAO Hong, et al.

　　(Department of Microbiology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089)

　　【Abstract】　Objective　To study the variation of EBV LMP1 encoding gene isolated from human nasopharyngeal carcinoma cell line SUNE1 in Guangdong.Methods　The EBV LMP1 gene was amplified from the SUNE1 cell genome by PCR and then the recombinant vector was constructed by inserting the PCR fragment into pcDNA3. The encoding EBV LMP1 spanning from exon1 to exon3 in recombinant vector was sequenced by the Sequence Analyzer.Results　The 1 312 bp encoding EBV LMP1 pieces in 2.6 kb PCR fragments were compared with the same EBV segments in B95-8 cell line. The data indicated that the rate of nucleotide sequence homology between the two fragments is 98.5% and the rate of amino acid is 96%. The restricted enzyme site of XhoⅠ in exon1 was deleted in SUNE1 but the 30bp deletion at the carboxyl terminus in most Chinese NPC LMP1 gene was not present.Conclusion　Although the LMP1 gene derived from SUNE1 had greater tumorigenicity than that derived from B95-8 cell, the high homology rate of nucleotide and amino acid sequences between them indicated that it was not the result from the variation of certain nucleotide sites but the change in amino acid domain.

　　【Key words】　Epstein-Barr virus　　Nasopharyngeal carcinoma　　Latent membrane protein 1 gene　　DNA sequencing

　　EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)与鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)的关系一直是人们研究的一个热点问题。EBV在人群中普遍易感，且可终生携带，但NPC的发生却有明显的地区性^［1］。对于NPC细胞中EBV的基因及病毒的存在状况，是长期以来未能解决的问题。LMP1基因由于它在EBV转化B淋巴细胞中起关键作用，而受到人们的普遍关注。目前，已有报道指出，EBV LMP1基因转染细胞接种裸鼠后可以形成肿瘤^［2］，同时LMP1基因在不同地域来源的NPC组织及不同分化程度的NPC之间，在序列上存在一定的差异。而来源于NPC组织的EBV LMP1的致瘤能力也明显高于EBV原型细胞株B95-8中的LMP1^［3］。因此，研究不同地区来源的NPC细胞中EBV LMP1核酸与蛋白的差异，对于更全面地了解EBV与NPC之间的关系具有重要的意义。

　　我国广东是NPC的世界最高发地区，为此我们选用了一株从广东地区NPC活检组织细胞中建立的NPC传代上皮细胞株SUNE1，对其进行EBV LMP1序列的测定，推导了其氨基酸序列，并与B95-8细胞中EBV LMP1基因进行了比较，以了解广东地区NPC病人中EBV LMP1的基因状况和变异特点。

　　1　材料和方法

　　1.1　细胞　SUNE1细胞由中山医科大学肿瘤研究所惠赠，本室保存。建株过程，按参考文献［4］进行。

　　1.2　质粒和菌株　克隆质粒载体pcDNA3由广州暨南大学移植免疫研究所惠赠。DH5α菌株为本室保存。

　　1.3　主要试剂　各种限制性内切酶、T4连接酶、Taq DNA聚合酶、低熔点琼脂糖凝胶分别购于上海Promega公司、德国Boechringer Mannheim公司。

　　1.4　引物设计及用途　根据文献［5］，参考EBV原型B95-8 EBV LMP1基因序列，设计PCR及测序引物，并在两条PCR引物中分别加入KpnⅠ(上游引物)及XbaⅠ(下游引物)酶切位点。所有引物均由上海生工生物工程公司合成。各引物位置、序列、用途如下：

　　PCR扩增引物：P1，5′GGTACCTACATAAGCCTCTCACACTG3′(上游引物，169 548 nt-169 527 nt)；P2，5′TCTAGAGAAGGTAAGAGTGCCATC3′(下游引物，166 913 nt-166 930 nt)。

　　测序引物：P1，5′GGTACCTACATAAGCCTCTCACACTG3′(169 548 nt～169 527 nt); P3, 5′ACTTATTGGAGATGCTCTGG3′(168 928 nt～168 947 nt); P4, 5′TATCTCCAACGAGGGCATAA3′(168 651 nt～168 670 nt); P5, 5′CAGTAAATGGAGGGAGAG3′(168 094 nt～168 111 nt); P6，5′TTATGCCCTCGTTGGAGATA3′(168 651 nt～168 670 nt); P7, 5′CCAGAGCATCTCCAATAAGT3′(168 928 nt～168 947 nt)。

　　1.5　EBV LMP1全基因PCR扩增、克隆与测序　以SUNE1细胞DNA为模板，用Expand^TMHigh Fidelity PCR System Kit扩增EBV LMP1全基因。方法参见说明书。PCR产物酶切后用低熔点琼脂糖回收，定向克隆到pcDNA3载体系统中，转化DH5α，挑取菌落，快速提取质粒，酶切鉴定。重组质粒命名为SLMP1-pcDNA3,并用ABI310自动测序仪进行EBV LMP1部分基因双链定向测序。所测序列覆盖LMP1基因第1外显子到第3外显子范围。

　　1.6　其他技术　细胞DNA模板提取、DNA酶切、回收、连接、质粒DNA提取等分子生物学技术见参考文献［6］。

　　1.7　软件　以DNA SIS分析核酸和氨基酸序列。

　　2　结果

　　2.1　重组载体SLMP1-pcDNA3的构建及鉴定。

　　2.1.1　重组质粒的构建　用PCR引物以SUNE1细胞DNA为模板，用PCR方法扩增出EBV LMP1全基因片段。在两端引物分别导入KpnⅠ及XbaⅠ酶切位点，以利于PCR产物定向插入pcDNA3载体质粒中，预计质粒大小为8 002 kb。质粒构建见图1。

图1　质粒SLMP1-pcDNA3构建过程

　　Fig.1　Scheme for the construction of plasmid SLMP1-pcDNA3

　　2.1.2　重组质粒的鉴定　重组质粒在1%琼脂糖凝胶中电泳，可见所需DNA片段，大小约8.0 kb，与预计值相符。用KpnⅠ、XbaⅠ及BglⅡ酶切鉴定重组质粒插入片段的大小和方向。结果表明目的基因LMP1插入片段在重组质粒中的大小和方向正确(见图2)。

图2　重组质粒的酶切图谱

　　1:分子量标准(λDNA/HindⅢ+EooRⅠ);2:用KpnⅠ和XbaⅠ酶切SLMP1-pcDNA3;3:SLMP1-pcDNA3用BglⅡ酶切

　　Fig.2　Restriction map of recombinant plasmid

　　1:Molecular marker(λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ. 2:SLMP1-pcDNA3 digested with KpnⅠ and XbaⅠ. 3:SLMP1-pcDNA3 digested with BglⅡ

　　2.2　重组质粒中EBV LMP1部分序列测定结果　重组质粒SLMP1-pcDNA3中，EBV LMP1全基因长度为2.6 kb， 其中包括LMP1转录启动子EDL1、LMP1的3个外显子、2个内含子及LMP1蛋白翻译polyA终止信号。对其中3个外显子及2个内含子共1 312 bp进行测序发现，SUNE1 EBV LMP1核酸序列与B95-8细胞EBV LMP1核酸的同源性为98.5%，由序列所推导的氨基酸序列的同源性为96%，其中LMP1基因5′端有XhoⅠ酶切位点的丢失(图3，4)。

图3　根据EBV LMP1基因编码区核苷酸序列推导的氨基酸序列

　　Fig.3　Alignments of the deduced amino acid sequence encoding EBV LMP1 of B95-8 and SUNE1

图4　B_95-8细胞及SUNE1细胞中EBV LMP1基因核酸序列

　　Fig.4　Alignments of nucleotide sequence of EBV LMP1 of B_95-8 and SUNE1

　　3　讨论

　　EBV的LMP1基因是一个具有肿瘤基因特性的基因，它所编码的蛋白是一种重要的、具有细胞转化活性的跨膜蛋白^［1］。以往的研究表明，来源于NPC组织或细胞的EBV LMP1基因与EBV原型B95-8细胞中的LMP1基因，在核酸及氨基酸序列上均有一定的差异。其中一个较有特征的变化是NPC中的EBV LMP1，在其第3外显子的C末端343号密码子对应的核酸序列起有30 bp碱基的缺失。而对中国人NPC组织或细胞来源的EBV LMP1的研究则显示，它们几乎都有LMP1第1个外显子XhoⅠ酶切位点的丢失^［7］。本研究结果显示，SUNE1中EBV LMP1第1外显子上的XhoⅠ酶切位点由于发生了T→C的突变，故而也形成了XhoⅠ酶切位点的丢失；此外SUNE1 LMP1第3外显子C末端并未发现有30 bp碱基的缺失，而它的致瘤能力却比B95-8 LIP1强^［8］，这似乎说明，LMP1第3个外显子C末端30 bp碱基的缺失并不是NPC细胞来源的LMP1致瘤性强于B95-8 LMP1的主要原因。这与Rowena等最近的研究结果一致^［9］。

　　从SUNE1 LMP1核酸序列推导其蛋白氨基酸的序列显示，在EBV LMP1的386个氨基酸组成中，SUNE LMP1的氨基酸有16个发生了改变，它们主要集中在LMP1的第3个外显子上，这种氨基酸组成的改变，对EBV LMP1基因在真核细胞中表达的影响，以及它们是否造成LMP1蛋白免疫原性的改变，从而导致NPC病人对LMP1蛋白免疫反应低下，对此问题作者正在研究中。然而与已发表的其他来源的EBV LMP1氨基酸序列比较^［10］，各来源的EBV LMP1蛋白氨基酸序列相互之间各不相同。其中究竟哪些碱基的突变能对LMP1的致瘤能力产生重要影响，目前还没有充分的证据。因此，推测EBV LMP1基因突变的致瘤强弱程度，主要取决于这些突变对LMP1蛋白结构域功能的影响，而不取决于具体哪些基因的突变。关于这一设想，国内外正在探索中。

　　由于LMP1基因在EBV感染及鼻咽癌发病中的重要性，研究不同地区鼻咽癌组织或细胞中的LMP1基因状态，将为进一步深入了解LMP1基因在鼻咽癌发生发展中的作用，以及为新型EBV疫苗的研制奠定基础。

　　参考文献

　　1　Alan B Rickinson, Ellioff Kieff. Epstein-Barr virus, In“Field virology”. Third Edition. Lippincott-Raven Publishers. Philadelphia. 1996.2397.

　　2　Hu L F Chen F Zheng X, et al. Clonability and tumorigenicity of human epithelial cells expressing the EBV encoded membrane protein LMP1. Oncogene, 1993, 8:1575-1583.

　　3　Hu L F, Chen F, Zhen Q F, et al. Differences in the growth pattern and clinical course of EBV-LMP1 expressing and non-expressing nasopharyngeal carcinomas. Eur J Cancer, 1995, 31:658-660.

　　4　吴荫棠，汪慧民，杨小平，等.鼻咽癌裸鼠移植瘤及其相应体外细胞株的建立与特性研究.癌症，1995，14：83-86.

　　5　Baer R, Bankier A T, Biggin M D, et al. DNA sequence and expression of the B95-8 Epstein-Barr virus genome. Nature, 1984, 310:297-211.

　　6　金冬雁，黎孟枫，等译.分子克隆实验指南.第二版.北京：科学出版社，1992年.

　　7　Hu L F, Zabarovsky E R, Chen F, et al. Isolation and sequencing of the Epstein-Barr virus BNLF-1 gene(LMP1) from a Chinese nasopharyngeal carcinoma. J Gen Virol, 1991, 72: 2399-2409.

　　8　陈宜芳，郭辉玉，汪慧民，等.鼻咽癌细胞系SUNE1中EBV-LMP1基因对永生化人胚肾上皮细胞生长特性的影响.中华肿瘤杂志，1998，20：330-332.

　　9　Johnson R J, Stack M, Hazlewood S A, et al. The 30bp deletion in Chinese variants of the Epstein-Barr virus LMP1 gene is not the major effector of functional differences between variant LMP1 genes in human lymphocytes. J Virol, 1998, 72:4038-4048.

　　10　Cheung S T, Leung S F, Lo K W, et al. Specific latent membrane protein 1 gene sequences in type 1 and type 2 Epstein-Barr virus from nasopharyngeal carcinoma in Hongkong. Int J Cancer 1998, 76;399-406.

(收稿：1999-02-03　　修回：1999-04-25)