鼻咽癌组织中人疱疹病毒6型感染及其临床意义

中华实验和临床病毒学杂志 1999年第3期第13卷 论著

作者：陈心春　简少文　汪慧民　曾木圣

单位：陈心春　(518020　深圳市东湖医院)；简少文　汪慧民　曾木圣　(中山医科大学肿瘤研究所)

　　关键词: 鼻咽癌；人疱疹病毒6型；EB病毒；LMP1

　　【摘要】　目的　探讨人疱疹病毒6型(HHV-6)与鼻咽癌(NPC)发病的关系。方法　采用聚合酶链反应(PCR)和原位杂交同时检测正常鼻咽组织和NPC癌前鼻咽组织以及NPC组织中HHV-6和EBV DNA的存在情况。采用免疫组化检测36例NPC组织的EBV LMP1 蛋白表达。结果　在42例NPC组织、21例鼻咽癌前病变组织中，经PCR检出HHV-6 DNA，阳性率分别为30.9%(13例)和4.7%(1例)。EBV DNA为95.2%(40例)和66.6%(14例)。27例正常鼻咽组织未检出HHV-6 DNA， EBV DNA为25.9%(7例)。经ISH，仅在13例PCR HHV-6 DNA阳性的NPC组织中检出11例阳性，36例NPC组织、10例鼻咽癌前病变组织ISH EBV DNA阳性。NPC组织的EBV LMP1蛋白阳性率为47.2%(17/36)。结论　鼻咽癌组织中存在HHV-6感染，提示HHV-6感染与NPC有关。HHV-6感染与EB病毒LMP1蛋白表达上调呈正相关，提示在NPC的发生中HHV-6可能直接参与和(或)通过上调EBV LMP1的表达而起一定作用。

The study on clinical significance of human herpesvius 6 infection of NPC tissues

CHEN Xinchun^*, JIAN Shaowen, WANG Huiming, et al.

　　(Shenzhen Eastlake Hospital, Shenzhen, 518020)

　　【Abstract】　Objective　To study the infection of human herpesvirus 6(HHV-6) in NPC and its role in the carcinogensis of NPC.Methods　By using polymerase chain reaction (PCR) and in situ hybridization (ISH) HHV-6 and EBV DNA to from the paraffin-embedded tissues of normal nasopharynx precancerous nasopharynx and nasopharyngeal carcinoma. EBV LMP1 was also detected in 36 tissues of NPC by immunohistochemistry (IHC).Results　HHV-6 DNA PCR were detected in 30.9%(13/42) of tissues of NPC, 4.7%(1/21) of precancerous nasopharynx and non in the normal nasopharynx. Within the same tissues, EBV DNA positive rates were 95.2%(40/42), 66.6%(14/21) and 25.9%(7/27), respectively. By using ISH, HHV-6 DNA were detected only in 11 NPC tissues out of 13 HHV-6 DNA positive NPC cases and EBV DNA were detected in 47.6%(10/21) of precancerous nasopharynx tissues and 85.7%(36/42) of NPC cases. EBV LMP1 expression were detected in 47.2%(17/36) of NPC tissues.Conclusion　NPC tissues can be infected with both HHV-6 and EBV, HHV-6 infection is correlated with the expression of EBV LMP1, suggesting that HHV-6 plays a direct/or indirect role in carcinogenesis of NPC via upregulating the expression of EBV LMP1.

　　【Key words】　NPC　　HHV-6　　EBvirus　　LMP1

　　鼻咽癌(NPC)的发生是一多因素多阶段的结果，EB病毒(EBV)感染与NPC发生密切相关，其他病毒的感染及其对EBV的激活作用也越来越受到重视。近年来的研究发现人疱疹病毒6型(HHV-6)与多种免疫疾病及恶性肿瘤的发生有关^［1，2］。1993年Kositantent^［3］首先报道NPC组织存在HHV-6的感染。其后Flammand等^［4］报道HHV-6能激活EBV。鉴于NPC和EBV的密切关系及HHV-6恶性转化的潜能，NPC中HHV-6的感染及其反式激活EBV可能具有十分重要的意义。对NPC中HHV-6能否感染鼻咽上皮细胞，HHV-6是否在体内同样能激活EBV，并协同EBV在NPC癌变过程中起作用等诸多方面的研究，将有助于阐明NPC发生的生物因素机制，并为NPC的防治提供依据。

　　1　材料和方法

　　1.1　PCR扩增组织切片中HHV-6SalI-L-B片段和EBV BamHIW片段　本组的27例正常鼻咽(No)21例重度异型增生和化生鼻咽(Pc)、42例鼻咽癌(Cc)石蜡包埋组织取自中山医科大学肿瘤医院病理科和鼻咽癌科。K₅₆₂细胞及携带EBV的B_95-8细胞株由该大学肿瘤研究所传代培养。HSB-2细胞及HHV-6GS毒株来自香港中文大学。TAQ酶、dNTP购自华美生物工程公司。PCR引物由加拿大真达公司合成。PCR扩增的HHV-6片段长186 bp，序列源于已克隆的HHV-6恶性转化序列pZVH14^［5］。EBV片段长129 bp，位于EBV的W片段^［6］。引物序列如下：HHV-6引物：H1：5′-CCCATTTACGATTTCCTGCACCACCTCTCTGC-3′，H2：5′-TTCAGGGACCGTTATGTCATTGAGCATGTCG-3′；EBV引物：EB1：5′-CCAGACAGCAGCCAATTGTC-3′，EB2：5′-GGTAGAAGACCCCCTCTTAC-3′。

　　每例组织切片2片，放入预先消毒好的离心管内。脱尽石蜡，去除残余的二甲苯，自然干燥后，加入含100 μg/ml蛋白酶K的PCR裂解缓冲液200 μl，置55℃水浴中消化过夜。煮沸10分钟。稍事离心即可取上清作PCR，亦可进一步酚仿抽提纯化。培养细胞则直接加裂解液消化，随后用酚仿抽提纯化。取上裂解液5 μl或纯化的DNA1 μl(1 μg)，于反应体积50 μl，在PE9 600扩增仪中PCR扩增，反应条件见参考文献［6-7］。反应结束后，取PCR产物10 μl于2%的琼脂糖凝胶电泳，溴乙淀染色，紫外光下观察并拍照记录。

　　1.2　原位杂交检测鼻咽组织中的HHV-6DNA及EBV DNA　以抽提纯化的感染HHV-6的 HSB-2DNA及B_95-8DNA作为模板，以DIG-11dUTP为标记物，采用PCR法标记制备HHV-6和EBV探针(按试剂盒说明操作，PCR引物及扩增条件同前1.1)。将组织连续切片，厚4～5 μm，贴于用APES处理过的载玻片上。56℃烤干半小时。二甲苯脱蜡，梯度酒精回水，50 μg/ml蛋白酶K消化，4%多聚甲醛后固定。于42℃湿盒预杂交1小时，再与含有上DIG-标记的HHV-6和EBV探针杂交液杂交过夜。在2×SSC和0.5%SDS中洗片，封闭半小时后，加酶联抗DIG孵育37℃1小时，用NBT/BCIP显色，2%甲基绿复染，二甲苯透明，中性树胶封片。

　　1.3　免疫组化检测鼻咽癌组织EBV LMP1　鼻咽癌石蜡组织切片于二甲苯中脱蜡，梯度乙醇回水，于微波炉中分别用高火、中低火、低火煮沸5分钟以充分暴露抗原。其后按DAKO试剂说明操作。显微镜下观察，按EBV LMP1阳性的棕色细胞数多少，将结果分为三个等级(+、++、++++)阳性染色强度。阳性染色强度差别代表着蛋白表达强度的差别：未见阳性细胞(-)，阳性细胞≤10%(+)，11～20%(++)，≥21%(+++)。

　　2　结果

　　2.1　PCR检测NPC组织中HHV-6 DNA和EBV DNA　HHV-6 DNA PCR扩增产物长度为186 bp，EBV BamHIW片段扩增产物长度为129 bp，与预期的分子大小相同(图1，2)。正常鼻咽组织和石蜡包埋不同阶段NPC组织中HHV-6 DNA及EBV DNA的存在情况见表1。

表1　PCR检测不同阶段鼻咽癌变组织中HHV-6和EBV DNA

　　Tab.1　Detection of HHV-6/EBV DNA in tissues of NPC at different periods of time by PCR

　　注：HHV-6 DNA　　Cc/Pc P＜0.05(χ²=4.14)

　　note:EBV DNA No/Pc　　χ²=9.49 P＜0.01, Cc/Pc χ²=4.42 P＜0.05

　　图1　NPC组织中HHV-6 DNA PCR产物电泳图

　　m：标准分子量，HHV-6(GS)感染的HSB-2细胞；6～7：阴性对照(B95-8 DNA和HSB-2 DNA)；2～5：NPC组织标本

　　fig.1　Agarose gel electrophoresis of PCR products of HHV-6 DNA of NPC tirlues

　　the size of PCR product of HHV-6 SalⅠ-B(pZVH14) DNA is 186 bp. M:pGEM-7Zf(+)/HaeⅢ marker. Lane 1:HHV-6 infected HSB-2 cell DNA. Lane2,3,4,5:Specimens of NPC. Lane6:B95-8 cell DNA, negative controe. Lane 7:HSB-2 cell DNA, negative control

图2　NPC组织中EBV DNA PCR 产物电泳图

　　M：标准分子量；1：阳性对照B95-8 DNA；7：阴性对照K562 DNA；2～6：NPC组织标本

　　Fig.2　Agarose gel electrophoresis of PCR products of EBV DNA of NPC tessase

　　The size of PCR product of EBV BamHⅠ W DNA is 129 bp. M:pBR322 DNA/BstNI marker. Lane 1:B95-8 cell DNA postitive control. Lane 2,3,4,5,6:Specimens of NPC. Lane 7:K562 DNA negative control

　　2.2　原位杂交检测鼻咽组织中HHV-6/EBV DNA　HHV-6及EBV DNA原位杂交阳性细胞核呈紫色或紫黑色，胞浆不着色。阴性细胞不着色。HHV-6 DNA的分布与EBV DNA的分布基本一致，主要分布在PCR的癌细胞核内，而在淋巴细胞及间质内未发现HHV-6/EBV DNA。原位杂交检测鼻咽组织HHV-6和EBV DNA的结果见表2。

表2　原位杂交检测鼻咽癌变不同阶段石蜡包埋组织中HHV-6/EBV DNA

　　Tab.2　Detection of HHV-6/EBV DNA in paraffin embedded tissues of NPC at different periods of time by ISH

注：HHV-6 DNA Pc/Cc P＜0.01 EBV DNA Pc/Cc P＜0.05(χ²=10.72)

　　2.3　NPC中HHV-6与EBV LMP1蛋白相关性检测　IHC法检测LMP1阳性细胞呈棕褐色，阴性细胞呈蓝色，背景清晰，鼻咽癌组织中EBV LMP1蛋白存在于癌巢肿瘤细胞的胞膜胞浆内，鼻咽癌组织的正常上皮细胞、淋巴细胞及间质未发现LMP1蛋白表达。IHC法检测EBV LMP1的结果见表3，4。

表3　NPC中HHV-6与EBV LMP1蛋白表达的相关性分析

　　Tab.3　Correlation of HHV-6 infection and EBV LMP1 expression in NPC

　　表4　NPC中HHV-6与EBV LMP1表达强度相关性分析

　　tab.4　Correlation of HHV-6 infection and the degree of　EBV LMP1 expression in nPC

　　3　讨论

　　HHV-6具有恶性转化潜能，已经发现HHV-6具有多个恶性转化潜能的基因片断^［7，8］，本工作检测的HHV-6序列位于HHV-6的Sall-L-B片段，克隆该片段的质粒体外能恶性转化鼠成纤维细胞NIH3T3及人上皮细胞系RHEK-1，转化细胞接种裸鼠成瘤^［7］。

　　我们利用PCR和ISH证实鼻咽癌组织中存在HHV-6感染，阳性率26.2%，HHV-6DNA主要分布在NPC的癌细胞核内，而在淋巴细胞及间质内未发现HHV-6/EBV dNA。正常鼻咽组织及鼻咽上皮异型增生和化生组织中，原位杂交未检出HHV-6 DNA。提示HHV-6可能恶性转化感染细胞，参与鼻咽癌发生过程。

　　HHV-6的另一显著特点就是，其具有反式激活作用。HHV-6及其多个基因(包括本组检测的pZVH14)能反式激活B淋巴细胞中的EBV，诱导EB病毒的抗原EA/VCA表达，使EBV从潜伏状态过渡到激活状态^［4，7］。而EBV的再激活与NPC的发生密切相关。本组13例PCR阳性鼻咽癌组织中11例原位杂交HHV-6阳性，其EBV dNA全部阳性，在连续切片下可以见到同一癌巢中的癌细胞同时存在HHV-6和EBV DNA。本研究还发现，NPC中HHV-6的感染与EBV LMP1表达呈正相关。而EBV lMP1是病毒的癌基因，在鼻咽癌变过程中起着重要的作用^［9］。提示NPC中HHV-6与EBV可能存在一定的相互作用。HHV-6可能通过某种途径，如反式激活上调EBV lMP1的表达，从而在NPC的发生中起到一定作用。参考文献

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　　9　Hu LF, Chen F, Zheng X, et al. Clonability and tumorigenicity of human epithelial cells expressing the EBV-encoded membrane protein LMP1. Oncogene, 1993, 8:1575-1583.

(收稿：1998-10-09　　修回：1999-04-17)