鼻咽癌组织端粒酶活性的表达

　　第一军医大学学报1999年第19卷第1期

彭宏　白庆生　董为人　王希军　杨光彩

　　摘　要：目的 为探讨端粒酶在鼻咽癌发生发展过程中的作用。方法 采用端粒重复片段扩增法（TRAP）对50例鼻咽部组织标本进行端粒酶活性检测。结果 鼻咽部慢性炎症、癌前病变组织端粒酶阳性率均为100%，鼻咽癌端粒酶阳性率为87.5%。本实验首次报道鼻咽部慢性炎症粘膜端粒酶活性表达较弱，但在癌前病变、鼻咽癌组织端粒酶活性明显增强，唯一1例高分化鳞状细胞癌检测不出端粒酶活性。结论 从慢性炎症、癌前病变到鼻咽癌的演变过程中，端粒酶可能在癌前病变期激活，并在鼻咽癌的发生发展过程中起着重要作用。端粒酶活性可能与鼻咽部鳞状细胞癌的恶性程度有关。

　　关键词：鼻咽癌　端粒酶

　　本文采用TRAP（Telomeric repeat amplification protocol）法对50例鼻咽部慢性炎症、癌前病变及鼻咽癌组织进行端粒酶活性检测，探讨端粒酶在这些组织中的表达及其意义。

　　　　1 材料和方法

　　1.1 研究对象 门诊病人鼻咽部活检标本50例，其中鼻咽部慢性炎症21例、癌前病变5例及鼻咽癌标本24例。一次取材，约20～40 mg组织立即放入液氮中储存备用，其余组织送病理活检。

　　1.2 组织提取物的制备 20～40 mg组织用冷缓冲液 [10 mmol/L HEPES-KOH(pH 7.5)，1.5 mmol/L MgCl₂，10 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT] 洗涤两次，滤纸吸干后放入预冷的匀浆器中，加入200 m l预冷的裂解缓冲液[10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)，1 mmol/L MgCl₂，1 mmol/L EGTA，0.1 mmol/L PMSF，5 mmol/L β-巯基乙醇，0.5% CHAPS，10%甘油]，匀浆后冰上孵育30 min，14 000 g 4 ℃离心30 min，收集上清液，紫外分光光度计测定蛋白质浓度，分装提取液，-70 ℃冻存。

　　1.3 端粒酶检测 采用Kim^[1]报道的TRAP法稍加改进进行测定。每一样本取5、0.5、0.05 m g蛋白提取物，加反应液至终体积50 m l [20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，1.5 mmol/L MgCl₂，63 mmol/L KCl，0.005% Tween-20，1 mmol/L EGTA，50 μmol/L dNTP，0.1 m g TS引物（5’-AATCCGTCGAGC-AGAGTT-3’）]，30 ℃孵育45 min，以完成端粒酶介导的TS引物延伸反应，97 ℃ 10 min灭活端粒酶，在冰上加入0.1 m g CX引物(5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3’)和2 U Taq酶，PCR扩增仪进行30次循环扩增，循环参数94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，最后一次循环再在72 ℃延长10 min。Hela细胞作为阳性对照，提取物加RNase(终浓度1 μg/ul)37 ℃孵育20 min作为阴性对照，反应液中以裂解缓冲液替代组织提取物作为空白对照。取15 μl PCR产物于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染观察，约从40个碱基开始的间隔6个碱基的梯度扩增产物为端粒酶阳性（图1）。

图1 端粒酶检测电泳图

　　Fig.1 Telomerase activity in primary nasopharyngeal carcinoma, premalignant lesions and nasopharyngeal mucosa with chronic nasopharyngitis

　　1,24: telomerase lysis buffer without tissue lysate. 2:Hela cell was the positive control .3,4,5,7 (mucosa with chronic nasopharyngitis),8,9,10,11 (premalignant lesions)and 12-16,19-22 (NPC samples) showed detectable telomerase activity. 6 (mucosa with chronic nasopharyngitis) and 23 (NPC sample) with RNase pretreatment showed no detectable telomerase activity. 17 (high-differentiated NPC) and 18 (low-differentiated NPC) showed no detectable telomerase activity. M: DNA marker (pBR322 /Hae III)

　　1.4 统计学分析 采用非参方法等级资料秩和检验进行两两比较统计学分析。

　　　　2 结果

　　100%（21/21）鼻咽部慢性炎症、100%（5/5）癌前病变（指鼻咽粘膜上皮化生伴不典型增生）、87.5%（21/24）鼻咽癌组织标本检出端粒酶活性。鼻咽癌24例标本中4例为泡状核细胞癌，19例为低分化鳞状细胞癌，仅1例为高分化鳞状细胞癌，其中10.5%（2/19）低分化鳞状细胞癌和100%（1/1）高分化鳞状细胞癌检测不出端粒酶活性。统计学分析表明，鼻咽癌、癌前病变端粒酶活性强于鼻咽部慢性炎症（P ＜0.01），癌前病变端粒酶活性与鼻咽癌无显著差别（P ＞0.05）。

　　　　3 讨论

　　端粒是指真核细胞线性染色体末端的一种特殊结构，由简单重复富含G的DNA序列及端粒结合蛋白组成。人类染色体端粒亚单位序列为5’TTAGGG 3’。在体外端粒形成发夹折叠的二级结构，为染色体末端提供了一个保护性“帽子” ，其生物学意义是：(1)防止染色体间相互融合、重组，使染色体免受外切酶、连接酶的破坏，避免DNA损失检查点的活化，保证线性染色体的稳定和完整，使真正的遗传信息得以完整复制，从而保证细胞的正常分裂。(2)端粒还能辅助染色体在细胞核内的定位，并参与基因表达的调控。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，是一种特殊的RNA依赖性DNA聚合酶。它能识别端粒3’的引物位点，并依靠逆转录机制以自身RNA为模板重复复制端粒序列，对维持染色体稳定性和完整性起着重要作用。端粒酶广泛存在于永生化细胞、癌细胞和生殖细胞。研究发现，人类绝大多数正常体细胞端粒酶处于失活状态，而大多数肿瘤细胞却表现端粒缩短并表达端粒酶活性。端粒酶活化是细胞永生化的必经途径，而获得永生是肿瘤恶变的重要一步。因此，衰老与端粒-端粒酶假说成为肿瘤研究的新模式^[2]。1994年Kim等^[1]采用端粒重复片段扩增法（TRAP）对12种肿瘤进行检测，发现90/101肿瘤组织和98/100永生细胞株检测到端粒酶活性，而在非永生化细胞、正常体细胞和良性肿瘤细胞中未检测到端粒酶活性。这种显著的相关性提示着在肿瘤细胞恶性状态的进展和维持中，端粒酶可能起到关键性作用。

　　3.1 本实验首先发现：100%鼻咽部慢性炎症粘膜端粒酶活性较弱表达，这可能与鼻咽部的特殊解剖结构有关。（1）鼻咽顶增殖体、咽隐窝内和咽鼓管咽口四周是咽淋巴内环的组成部分，含有丰富的淋巴细胞。本实验慢性炎症的标本取自肉眼见局限性隆起或粗糙或结节状增生的鼻咽部粘膜组织，病理诊断：鼻咽部粘膜慢性炎症，粘膜及粘膜下淋巴细胞浸润，甚至淋巴细胞增生活跃，但排除鼻咽癌。而研究发现，人正常淋巴细胞可有端粒酶活性较弱表达^[3.4]。（2）EB病毒感染的人B淋巴细胞在永生化过程中伴随着端粒长度缩短和端粒酶激活^[5]。这提示，正常鼻咽部粘膜端粒酶活性表达可能与EB病毒感染的克隆细胞永生化有关。这些克隆细胞与鼻咽癌的发生发展有无直接关系，值得进一步研究。

　　3.2 端粒酶不仅在鼻咽癌组织中，而且在癌前病变期的组织中活性表达明显增强，表明肿瘤发生前端粒酶活化可能与细胞表型的演变和不典型增生有关。黄腾波等^[6]从1986年以来对广东省四会市和广州市54 425名健康人群的前瞻性观察发现有鼻咽部粘膜癌前病变者癌变率高。100%癌前病变组织端粒酶活性明显增强，提示端粒酶活化在鼻咽癌的发生过程中可能起着重要作用。端粒酶结合EB病毒抗体的检测有利于鼻咽癌高危病人的筛选和追踪观察，在提高鼻咽部粘膜癌变预测及鼻咽癌早期诊断方面具有良好的临床应用前景。

　　3.3 头颈部是致癌物首先攻击的部位，整个呼吸消化道上段随着暴露于致癌物的时间延长，其癌症发病危险性增加，故称为癌化区（Field cancerization）。研究发现：80%～87.5%原发头颈部肿瘤（口腔、咽、喉部鳞状细胞癌）有端粒酶活性表达，在口腔恶性肿瘤中端粒酶阴性者均为高分化鳞状细胞癌，而100%中、低分化鳞状细胞癌均有端粒酶活性表达，提示端粒酶活性与肿瘤恶性程度有关^[7~9]。本实验89.5%（17/19）低分化鳞状细胞癌和100%泡状核细胞癌端粒酶活性阳性，唯一1例高分化鳞状细胞癌检测不出端粒酶活性，提示端粒酶活性可能与鼻咽部鳞状细胞癌的恶性程度有关。

　　肿瘤的发生机理及细胞的恶性转化机理一直被认为是多基因突变导致细胞正常生长失控的结果。90年代后人们认为端粒酶的表达过程是一个新的肿瘤发生模型。1991年，美国临床肿瘤协会在27届年会上提出了今后癌症治疗的八大新领域，端粒酶抑制剂被列为其中之一，针对端粒酶的肿瘤治疗具有广阔的研究和应用前景。我们已经对鼻咽部组织进行端粒酶活性定量研究，以期进一步了解鼻咽癌发生发展过程中端粒酶活性的变化规律，为以端粒酶为靶点的鼻咽癌治疗提供依据。

　　致谢

　　本实验得到第一军医大学生物化学教研室吴翔硕士，单越新、胡亚芳博士，病理教研室张素娟高级实验师及中山医科大学卫生毒理学教研室陈雯副教授的帮助，徐钤教授对课题的设计提出许多宝贵意见，图书馆情报室张杰民副研究馆员为本文提供情报检索，谨此一并致谢。

　　作者简介：彭宏，女，1966年出生，1988年毕业于第一军医大学学院：本科，主治医师，讲师，电话：85187323

　　作者单位：彭宏　白庆生　王希军：第一军医大学南方医院耳鼻喉科

　　董为人：组织胚胎教研室

　　杨光彩：生物化学教研室，广州，510515

　　参考文献

　　1 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, 266(23): 2011

　　2 彭 宏，王希军，杨光彩．端粒、端粒酶与头颈部肿瘤．医学综述,1998,4(2):66

　　3 Pan C, Xue BH, Ellis TM et al. Changes in telomerase activity and telomere length during human T lymphocyte senescence. Exp Cell Res, 1997, 31(2): 346

　　4 Hiyama K, Horao Y, Kyoizumi S et al. Activation of telomerase in human lymphocytes and hematopoietic progenitor cells. J Immunol, 1995, 155 (8): 3711

　　5 Counter CM，Botelho FM，Wang P et al．Stabilization of short telomeres and telomerase activity accompany immortalization of Epstein-Barr virus-transformed human B lymphocytes．J Virol,1994,68:3410

　　6 黄腾波,陈德林,黄惠明等.鼻咽癌在不同高发区人群中的发病差异. 癌症,1998,17(2):84

　　7 Mutirangura A, Siplyaphun P, Triekapan S et al. Telomerase activity in oral leukoplakia and head and neck aquamous cell carcinoma. Cancer Res, 1996，56(15):3530

　　8 Califano J, Ahredt SA, Meininger G et al. Detection of telomerase activity in oral rinses from head and neck squamous cell carcinomal patients. Cancer Res, 1996,56(24): 5720

　　9 Kannan S, Tahara H, Yokozaki H et al. Telomerase activity in premalignant and malignant lesions of human oral mucosa. Cancer Epidemiol Biomarks Prev, 1997,6(6): 413