鼻咽癌组织中EB病毒LMP1的表达与癌细胞增殖和凋亡的关系＊
癌症1999年第18卷第1期
刘克拉 宗永生 张昌卿 张锋 冯凯涛
摘 要 目的：探讨EB病毒编码的LMP1在体内鼻咽癌细胞中，是否可能通过影响鼻咽癌细胞增殖和凋亡的生物学过程，而在鼻咽癌的发展演进过程中起作用。方法：采用TUNEL法原位检测癌细胞的凋亡程度，用免疫组化LSAB法检测LMP1、PCNA、p53和bcl－2蛋白表达；分析LMP1的表达与癌细胞增殖、凋亡以及与p53、bcl－2表达的相关性。结果：LMP1的表达与否，与鼻咽癌细胞增殖活性的差异无显著意义，而与癌细胞凋亡程度之间的差异有显著意义，其表达与癌细胞凋亡程度呈正相关；LPM1的表达与p53和bcl－2的表达无相关性。结论：提示LMP1在体内鼻咽癌组织中可能有促使癌细胞凋亡的生物学作用，其机制可能是通过激活细胞毒性T淋巴细胞，增强后者对癌细胞的杀伤作用。LMP1对癌细胞增殖和凋亡的作用可能并不受p53及bcl－2表达的影响。
主题词：鼻咽肿瘤 EB病毒 细胞凋亡
EB病毒潜伏期膜蛋白(Latent membrane protein1,LMP1)是目前唯一被证实具有癌基因编码蛋白特性的EB病毒基因产物。体外实验表明，LMP1对啮齿类动物的纤维母细胞有转化作用，表达LMP1的Rat-1细胞在裸鼠体内具有成瘤性。LMP1还能诱导转基因小鼠皮肤表皮增生，并可抑制表皮细胞的终末分化[1]。但在与EB病毒密切相关的人体鼻咽癌组织中，LMP1是否影响鼻咽癌细胞增殖和凋亡的生物学过程，与影响细胞增殖和凋亡的p53和bcl－2表达之间是否存在联系，目前尚未见有关报道。本文旨在对上述问题作一初步探讨。
1 材料和方法
1.1材料
36例和18例未经治疗的鼻咽癌活检组织分别取自中山医科大学肿瘤医院病理科和病理教研室，病理组织学诊断均为鼻咽非角化性癌(NKC)。临床分期(UICC)属T1～2N0M0者24例，
t1～2N1～3M0者30例。患者均为广东籍居民，年龄最大者69岁，最小者29岁，平均年龄46-8岁，男女性别比为2.4∶1。取该54例鼻咽癌石蜡包埋组织作4μm厚切片及免疫组化和凋亡细胞检测。
1.2免疫组化法
采用常规LSAB法。LMP1(OT17-2)单克隆抗体为Organon Teknika公司产品，由Dr.Middeldorp JM惠赠，工作稀释度为1∶50；PCNA、p53、bcl-2抗体均为Dake公司产品，工作稀释度分别为1∶100、1∶80、1∶80；以B95-8细胞涂片作LMP1阳性对照，以封闭血清(bolocking)代替一抗作阴性对照。阳性标准：阳性染色为明确的棕黄色细颗粒状。LMP1为胞膜和胞浆阳性；p53和PCNA为胞核阳性；bcl-2为胞浆阳性。根据各观测指标阳性细胞比率均数大致确定分级标准。LMP1阳性细胞≥5％者为阳性，≤4％者为阴性；PCNA阳性细胞＞50％者为+++，25％～49％为++，1％～24％为＋；p53和bcl-2以阳性细胞比率≥25％为阳性，＜25％为阴性。
1.3细胞凋亡原位检测方法
本实验采用末端脱氧核苷酸转移酶介导核苷酸缺口标记法(TUNEL)，检测试剂盒为Boehringer Mannheim公司出品。碱性磷酸酶底物(BCIP/NBT)为Dako公司产品。蛋白酶K(PK)为Sigma公司产品。方法：切片经脱蜡、水化后滴加PK液(30μg/ml,10mmol/LTris/HCl,pH7-4)，37℃温箱内孵育15分钟。用PBS洗去PK液后滴加TUNEL反应液，37℃孵育1小时。PBS洗去反应液后滴加碱性磷酸酶联接的抗荧光素抗体(Converter-AP)，37℃孵育30分钟。滴加碱性磷酸酶底物(BCIP/NBT)，室温下反应15～20分钟。水洗后用2％甲基绿复染，中性树胶封片，光镜下观察。以反应性增生的淋巴结作细胞凋亡原位检测阳性对照。阳性结果判断标准：凋亡细胞胞核和/或胞浆内出现蓝紫色颗粒。细胞凋亡程度分级标准：光镜下用高倍视野对每例组织切片中癌组织区域连续数1000个细胞，计算其中阳性细胞所占比率，阳性细胞比率＞10％为+++；4％～9％为++；1％～3％为＋。
1.4统计学方法
采用OXSTAT-II(Version4.0WalterSJ.)统计软件作统计分析。
2 结果
免疫组化方法检测54例鼻咽癌，其中LMP1阳性者占48.1％(26/54)(图1)；PCNA在癌细胞中均呈不同程度的阳性，p53阳性率为75.9％(41/54)，p53阳性者多属未分化癌，癌细胞异型性较大(图2)。bcl-2阳性率为75.9％(41/54)，除癌细胞阳性外，间质部分淋巴细胞也呈阳性(图3)。p53和bcl-2共同表达阳性者占64.8％(35/54)，两者均阴性者为12.9％(7/54)。
图1 癌细胞胞浆和胞膜LMP－1阳性LMP－1LSAB法10×10
图2 癌细胞胞核p53阳性p53LSAB法10×10
图3 癌细胞和部分间质淋巴细胞核bcl－2阳性；bcl－2LSAB法10×10
用TUNEL方法原位检测凋亡细胞，见凋亡细胞多呈单个散在分布，也可见数个凋亡细胞呈小灶性聚集；凋亡细胞核多呈边缘不规则紫蓝色团块状和松散细颗粒状；少数凋亡细胞核仍保持圆形或卵圆形，阳性信号呈浅紫蓝色定位于核内(图4)。根据凋亡细胞所占比率确定细胞凋亡程度的分级，在54例非角化性癌中，1＋者占24.1％(13/54)；2＋者占33.3％(18/54)；3＋者占42.6％(23/54)。
图4 凋亡癌细胞胞核见紫蓝色阳性颗粒TUNEL法，甲基绿复染10×10
以增殖细胞核抗原(PCNA)表达强度反映癌细胞的增殖活性。经统计学分析，LMP1表达与否在癌细胞增殖方面的差异无显著意义，但在癌细胞凋亡程度方面的差异有显著性意义，表明LMP1阴性者癌细胞凋亡程度低，LMP1阳性者则癌细胞凋亡程度高(见表1)。
表1 LMP1的表达与癌细胞增殖活性、凋亡程度的关系
|
LMP1 |
n |
PCNA |
细胞凋亡 |
|
- |
+ |
- |
+ |
|
－ |
28 |
11 |
17 |
5 |
23 |
|
＋ |
26 |
4 |
22 |
10 |
16 |
| 合计 |
54 |
15 |
39 |
15 |
36 |
| χ2 |
|
5.407 |
7.476 |
| P值 |
|
＞0.05 |
＜0.05 |
p53阳性和阴性表达在癌细胞增殖活性方面的差异经统计学分析有极显著意义，表明p53阳性者癌细胞增殖活性较高，反之则较低；但p53的表达与否在癌细胞凋亡方面的差异无显著意义。统计学分析表明，bcl-2阳性和阴性表达在癌细胞增殖及凋亡方面的差异均无显著意义。经统计学分析表明LMP1的表达与p53、bcl-2的表达无相关性(见表2)。
表2 LMP1的表达与p53、bcl－2表达的关系
| LMP1 |
n |
p53 |
bcl-2 |
| - |
+ |
- |
+ |
| － |
28 |
11 |
17 |
5 |
23 |
| ＋ |
26 |
4 |
22 |
10 |
16 |
| 合计 |
54 |
15 |
39 |
15 |
39 |
| χ2 |
|
2.756 |
3.714 |
| P值 |
|
＞0.05 |
＞0.05 |
3 讨论 关于LMP-1在鼻咽癌中的阳性率各文献报告不一，就蛋白质水平表达而言，用免疫组化方法和Western blot方法检测结果也有所不同。本文结果显示LMP-1阳性检出率为48.1％(26/54)，与Young等[2]的结果基本一致，说明只有部分病例鼻咽癌组织中有LMP-1表达。体外实验表明，LMP1对上皮细胞的增殖和恶性转化可能有促进作用，但在体内其对细胞增殖的作用尚不明确。本文结果表明LMP1与鼻咽癌细胞的增殖活性无相关性，提示LMP-1在鼻咽癌的发生阶段和发展演进阶段的生物学作用可能有所不同。
体外实验研究还表明，EB病毒基因BNLF1编码的LMP-1可通过上调bcl-2的作用而阻断B淋巴细胞的凋亡[3]。但也有报道在人Burkitt's淋巴瘤细胞株，EB病毒感染后可使瘤细胞凋亡增加[4]。最近Lu等[5]发现将LMP-1基因导入人上皮细胞(RHEK-1)后，细胞的凋亡明显增加。但EB病毒基因产物在体内对鼻咽癌细胞凋亡究竟有何作用，迄今未见报道。本文结果表明，LMP-1的表达与癌细胞的凋亡存在相关性；LMP-1阳性者，癌细胞凋亡程度高，LMP-1阴性者，癌细胞凋亡程度低。提示在未经治疗的鼻咽癌细胞中，LMP-1的表达很可能是促使或诱导癌细胞自发性凋亡的重要因素之一。
体外实验表明，LMP-1对培养中的多种细胞株具有细胞毒性作用[6]。但LMP-1在体内促使细胞凋亡的作用机制不明。早期的研究表明，带有EB病毒的靶细胞表面存在淋巴细胞确定的膜抗原(LYDMA)，LYDMA可激发机体产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别和杀伤该靶细胞。后来的研究认为，LYDMA很可能就是LMP[7]，进一步研究发现，位于EB病毒感染细胞外表面的LMP三段多肽中，有一个由10个氨基酸组成的片段能特异性诱导CTL[8]。近年来有报道，LMP－1可诱导上皮细胞表达CD70，大多数LMP－1阳性的鼻咽未分化癌细胞都存在CD70的表达。CD70是T细胞表面蛋白CD27的配体[9]，其表达有利于癌细胞与T淋巴细胞通过受体配体结合。最近研究表明，鼻咽癌细胞LMP－1表达阳性者B7家族蛋白也阳性，B7蛋白是CTL激活的共刺激信号(co－stimulatory signal)，癌细胞表面B7蛋白的表达可使其免疫原性增加，从而能更有效地刺激局部免疫反应[10]。基于以上认识，作者认为：鼻咽癌细胞的自发性凋亡，很可能是以CTL为主的T淋巴细胞局部免疫反应的结果，而LMP－1对于激活T淋巴细胞而介导癌细胞凋亡具有重要的生物学作用。据报道，LMP－1阳性的鼻咽癌患者预后较阴性者好[11]，可能与LMP－1的这种生物学功能有关。
本文结果表明在鼻咽癌中bcl－2阳性率高达75.9％，但其表达与LMP－1的表达并无相关性，在LMP－1阴性者中bcl－2阳性率仍高达88.5％；这与Lu等的报道一致[12]。提示可能LMP－1上调bcl－2的功能具有细胞类型的特异性，在鼻咽癌细胞中LMP1并无上调bcl－2表达的功能。进一步分析表明，bcl－2的表达与否与癌细胞凋亡程度之间无相关性。提示鼻咽癌细胞中bcl－2的高表达并不能抑制癌细胞凋亡。此结果也从另一角度说明鼻咽癌细胞的凋亡很可能是一种局部T淋巴细胞介导的靶细胞凋亡，因此并不受bcl－2的抑制[13]。
本文检测54例鼻咽非角化性癌p53阳性表达率为75.9％，统计学分析表明p53是否过度表达与癌细胞凋亡程度无相关性，但与癌细胞的增殖活性却明显相关。提示在鼻咽癌细胞中p53蛋白积聚对癌细胞凋亡无影响，但对于癌细胞的增殖具有促进作用。本实验所采用的单克隆抗体(DO-7)可同时检测野生型p53和因突变或与其它蛋白结合而失活的p53，由于野生型p53半衰期很短，免疫组化方法难以检出，实际上检测出的p53多属于后者，这种失活的p53蛋白已丧失促进细胞凋亡和抑制细胞增殖的功能。以往研究表明，鼻咽癌中p53突变率并不高。因此推测p53功能失活更可能是由于与其它细胞蛋白或病毒蛋白结合的结果。虽然本文统计学分析未能表明p53与LMP1的表达有相关性，但不能排除在鼻咽癌细胞中某些EB病毒编码蛋白与p53结合而使之失活的可能。
＊本课题为国家“九五”攻关研究项目分题(96－906－01－03)
作者单位：刘克拉（中山医科大学肿瘤医院病理科(广州，510060；E－mail:klliu@gzsums.edu.cn)）
宗永生（中山医科大学病理教研室）
张昌卿 冯凯涛（中山医科大学肿瘤医院中心实验室）
张锋（中山医科大学肿瘤医院鼻咽癌科）
参考文献
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