鼻咽癌组织HSP27与P53、P21癌基因蛋白表达相关性研究
同济医科大学学报2000第29卷第4期
刘立思 肖成峰 甄宏韬 刘争 何琼钦
摘 要：探讨鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)组织中热应激蛋白27(heat stress p rotein 27, HSP27)，P53及P21癌基因蛋白表达水平及其相互关系，采用间接免疫荧光染色和SABC相结合的双重荧光染色法，分析3种蛋白在鼻咽癌发生、发展及预后中的作用。结 果发现： 32例NPC中HSP27，P53和P21阳性表达比例(阳性率)分别为83.8%、50%、93.8%；8例鼻咽增生性炎症组织中三者比例为4/8、0/8、4/8；4例正常组织则全部阴性表达。HSP27、P53、P21的共表达以HSP27与 P21的共表达最为显著，且与NPC恶性程度和临床分期有关。提示：HSP27及P21阳性表达可能是NPC发生的早期变化，可将二者联合作为NPC早期诊断及预防的敏感生物标志物。
关键词：鼻咽癌；热应激蛋白27；P53；P21
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一种恶性程度很高的肿瘤，在我国南方五省极为常见。NPC的致病因素目前不太清楚，一般认为与遗传因素、EB病毒感染及环境因素长期刺激有关。机体在接触这些刺激因素及病毒感染导致病变的同时，还合成一种被称为热应激 蛋白(heat stress proteins, HSPs)的蛋白质［1,2］。HSPs增强了机体适应各种不利因素的能力，参与热耐受及毒物耐受的形成［2］。更为重要的是，HSPs作为“分子伴侣”，参与新合成蛋白质的折叠、装配和运输，防止蛋白质变形和聚集，帮助损伤蛋白质的再折叠或降解。HSPs分为很多家族，其中小分子量的HSPs如27 ku的HSP(heat stress p rotein 27, HSP27)与肿瘤尤其乳腺癌关系密切［3,4］。HSP27与NPC之间的关系目前未见研究，为此，探讨HSP27在NPC组织中的表达及其与癌基因蛋白P53，P21表达的相互关系，对于评价NPC的发生、发展及预后，以及采取不同治疗方式增加疗效有重要意义。
1 材料与方法
1.1 实验材料
收集1998～1999年期间经病理活检确诊的34～60岁 NPC组织32例，按照1992年全国鼻咽癌学术会议提出的鼻咽癌分期方案进行临床分期。鼻咽增生性炎症组织8例及正常鼻咽组织4例作对照。收集的新鲜组织立即于－70 ℃冻存，24 h后转入液氮罐中保存。
取出冰冻组织，于－30 ℃下连续切片，切片厚5 μm，－20℃丙酮固定20 min，晾干，用 于HSP27，P53及P21免疫荧光染色。
1.2 实验方法
1.2.1 主要试剂：兔抗人HSP27(加拿大Laval大学TanguayRM教授惠赠)，小鼠抗人P53及小鼠抗人P21单克隆抗体(Sigma公司产品)，异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔IgG和Cy3-SABC试剂盒(武汉博士德公司)。Cy3为博士德公司推出的一种新型荧光素，在554nm处激化，在568～574nm发射红色荧光，与FITC的黄绿色荧光鲜明区分。所用的每一种试剂首先按说明作预试验，选择其最适反应滴度。
1.2.2 检测方法:采用间接免疫荧光法(检测HSP27)和SABC法在同一张切片上进行双重荧光染色。同时检测HSP27和P53，HSP27和P21的表达。荧光显微镜(Olympus公司)下观察时，通过转换不同滤镜来观察两种荧光。由于荧光极易衰减，因此观察和评价宜迅速进行。用PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性样本作阳性对照。
1.2.3 结果观察与判断：HSP27由于被FITC间接标记而发黄绿色荧光，P53和P21则发红色荧光。根据荧光的有无和强弱按如下标准分级［5］：“－”，无或可见微弱光“+”，仅能见明确可见的荧光；“
”，可见明亮的荧光；“
”，可见耀眼的荧光。
1.2.4 统计学处理:数据经统计软件Stata5.0处理,各组的统计学检验用直接概率法，P值计算均用精确概率法。
2 结果
2.1 HSP27，P53和P21在NPC、鼻咽增生性炎症组织及正常组织中的表达阳性率 由表1可见HSP27，P53和P21在NPC中显著高表达，而鼻咽增生性炎症组织中HSP27和P21各有4例阳性。HSP27与P21阳性表达特征为位于胞浆，HSP27分布比较均匀，呈黄绿色，P21则靠近胞膜区明显。P53主要位于胞核，胞浆也有较弱分布。NPC同一组织中HSP27与P53，HSP27与P21，P53与P21以及三者共同表达的分别有16、28、16、14例。显示三者之间有较强的共表达，尤其以HSP27和P21共表达更为显著(28/32)，见表1。
表1 HSP27，P53和P21在NPC、鼻咽慢性炎症组织及正常组织中的表达阳性率
| |
例数 |
阳性率（%） |
| HSP27 |
P53 |
P21 |
| NPC |
32 |
87.5 |
50.0 |
93.8 |
| 鼻咽增生性病变组织 |
8 |
50.0 |
0.0 |
50.0 |
| 正常组织 |
4 |
0.0 |
0.0 |
0.0 |
与正常组织比较 P＜0.012.2 HSP27，P53和P21蛋白阳性表达与NPC分化程度、临床分期及淋巴结转移之间的关系
从表2可见，尽管NPC患者大多在46岁以上，但HSP27，P53与P21表达并无年龄上的差异性。对于有颈淋巴结转移的病例，三种蛋白表达显著升高(表2)。
表2 HSP27，P53和P21阳性表达与NPC分化程度、临床分期及淋巴结转移之间的关系
| |
例数 |
阳性例数 |
| HSP27 |
P53 |
P21 |
| 年龄 |
|
|
|
|
| 34～45 |
10 |
8 |
4 |
8 |
| 46～60 |
22 |
20 |
12 |
22 |
| 性别 |
|
|
|
|
| 男 |
20 |
16 |
10 |
18 |
| 女 |
12 |
12 |
6 |
12 |
| 分化程度 |
|
|
|
|
| 高分化 |
12 |
8 |
2 |
10 |
| 低分化 |
12 |
12 |
8 |
12 |
| 未分化 |
8 |
8 |
6 |
8 |
| 临床分期 |
|
|
|
|
| Ⅰ |
14 |
10 |
4 |
12 |
| Ⅱ |
6 |
6 |
4 |
6 |
| Ⅲ |
2 |
2 |
0 |
2 |
| Ⅳ |
10 |
10 |
8 |
10 |
| 淋巴结转移 |
|
|
|
|
| 有 |
18 |
18 |
14 |
18 |
| 无 |
14 |
10 |
2 |
12 |
2.3 32例NPC组织中HSP27，P21, P53表达水平分级
可见NPC分化程度越低,HSP27，P21及P53阳性率越高，表达水平也愈强,见表3。
表3 不同分化程度NPC中HSP27，P21, P53表达水平
3 讨论
P53与ras癌基因及其表达产物在肿瘤中的作用已基本为人们所认识。在肿瘤发生过程中各种 致癌因素使p53基因突变，使其失去细胞负增长调节作用，导致变性P53蛋白质聚集［6］。 用免疫组化方法检测到的变性P53蛋白表达及其水平可间接反映这一变化。ras癌基因家族共同表达的P21蛋白，是细胞浆内参与跨膜信号传递的主要物质，对细胞生长刺激信号起调节作用。当ras基因发生突变时，细胞内的信号持续传导,致细胞无限增长而引发癌变［7］。 本研究发现，NPC组织中P53, P21显著高表达，鼻咽增生性炎症中4例也有一定表达，正常组织则均为阴性。HSP27是小分子量HSPs家族成员之一。在高温、细菌及病毒感染、环境刺激性物质等作用下可诱导表达［1,2］。有关HSP27与肿瘤关系的文章不断有报道。肿瘤组织中HSP27表达普遍 增加，同时对热疗及化疗药物敏感性降低［2,8］。热或药物耐受状态的形成是 hSP2 7的一 个重要功能。此外，HSP27还可作为“分子伴侣”，促进新合成的蛋白质折叠、装配和运输，促进受损或变性的蛋白质恢复功能或进一步降解［1］。Orit等［9］发现HS ps可以与突变 型P53蛋白结合，使其向野生型转变。HSPs与P53结合成稳定的复合物存在于胞核，有时也转移至胞浆较长时间存在。张永幸等［10］发现职业性肺癌中HSP70与P53有较强共表达。本研 究发现，HSP27不仅与P53有共表达(16/32)，与P21同时表达的比例更高(28/32)，三者同时阳性表达的也有14例。提示HSP27作为“分子伴侣”，可能与P53及P21结合，促使其稳定，并参与了变性P53或P21功能的恢复或降解。
从病因学角度分析，环境致癌物的长期刺激及EB病毒感染与NPC的发生高度相关。这些不利因素又可使机体表达HSP27，鼻咽增生性炎症组织中HSP27表达升高，根据对HSP27的功能的研究，其高表达是一种细胞保护性反应。那么一旦这种保护性反应消失或减弱，即HSP27的不表达和/或表达降低与NPC的发生是怎样的关系呢？目前仍不清楚。NPC组织分化越差、临床分期越晚，其HSP27表达水平越强，可能有以下几个方面的原因：①一种或多种基因突变如p53、 ras突变后其异常表达产物激活了热休克转录因子，促使HSP27高表达，NPC分化越低，这种基因突变程度越强，因而HSP27表达越高；②NPC分化越差，其向周围组织浸润或转移能力越强，刺激了NPC周围组织及其本身HSP27的表达升高。HSP27这种表达差异使分化程度越低的NPC对放射治疗或化疗更加不敏感，细胞生存能力更强。因此，HSP27在NPC中的表达差异性不仅用于判断预后，对于治疗方式的选择也有一定作用。通过认识HSP27表达规律，选择不同方式的放射治疗，或放疗与化疗相结合，或者运用某种方式控制HSP27的表达后再进行放疗或化疗往往可能取得意想不到的治疗效果。ras癌基因产物P21在鼻咽增生性炎症组织中也有一定阳性，提示已有细胞生长信号传导系统的紊乱。然而对鼻咽增生性炎症与NPC的发生关系尚缺乏深入研究。P21在NPC中的表达类似于HSP27。因此，NPC发生、发展过程中HSP27、P21和P53的表达有其共同的规律性，即NPC的恶性程度越高、分期越晚并伴有颈淋巴结转移者三者表达愈强。因而可以推测：NPC的发生是HSP27、P21、P53以及其他相关基因突变后交互作用的结果。其具体机制及意义仍需日后深入研究。
刘立思，男，1951年生，副教授刘立思（同济医科大学附属同济医院耳鼻咽喉科，武汉 430030)
肖成峰（同济医科大学公共卫生学院职业医学研究所，武汉 430030)
甄宏韬（同济医科大学附属同济医院耳鼻咽喉科，武汉 430030)
刘争（同济医科大学附属同济医院耳鼻咽喉科，武汉 430030)
何琼钦（湖北省汉川市第二人民医院耳鼻喉科，汉川 432300）
参考文献
1，Morimoto R I, Tissieres A, georgopoulos C. Progress and perspectives on the biology of heat shock proteins and molecular chaperones. In: Morimoto R I， Tissieres A, Georgopoulos C et al. the biology of heat shock protei ns a nd molecular chaperones. New York: Cold spring Harbor Laboratory Press, 1994, 1 ～30
2，Tangchun Wu, Yuan Ye, Wu Yang et al. Presence of antibodies to h eat stress protiens and its potential significance in workers exposed to benzenc e and patients with benzene-poisoning. Cell Stress and Chaperone, 1998,3:161 [ ZK)
3，Ciocca D R, Oesterreich S, Chamness G C et al. Biological and cl inic al implications of heat shock protein 27,000 (Hsp27): a review. J Natl Cancer In st,1993,85:558
4，Love S, King R J. A 27 kDa heat shock protein that has anormalous pr ognostic powers in early and advanced breast cancer. Br J Cancer, 1994,69:743
5，蔡文琴, 王伯云主编.适用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都: 四川科学技术出版社, 1994.67～68
6，Gottlied T M, Oren M. p53 in growth control and neoplasis. Biochem Biophys acta, 1996,1287:77
7，McCormick F. Ras-related proteins in signal transduction and growth control. mol Reprod Dev, 1995,42:500
8，Fuqua S A, Oesterreich S, Hilsenbeck S G, et al. Heat shock prot eins and drug resistance.Breast Cancer Res Treat, 1994,32:67
9，Elledge R M， Clark G M. p53 protein accumulative detected by five different antibodies: relationship to progress and HSp70 in breast cancer. Canc er Res, 1994,54:3752
10 张永幸, 贺涵贞, 邬堂春等. 职业性肺癌中热应激蛋70、热应激蛋白27与p53表达的相关性研究. 中华劳动卫生职业病杂志, 1998,16(2):78
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