粘附分子CD44v6表达和p53基因突变与卵巢癌转移关系的研究

　　中华妇产科杂志2000年第35卷第4期

孙宜　 沈仲毅　 季晓琼

　　 摘要　目的：探索卵巢癌粘附分子CD44的变构体CD44v6表达和p53基因突变与卵巢癌转移之间的关系和作用机理。方法：选择正常卵巢20例、良性卵巢肿瘤20例、卵巢癌45例（其中20例肿瘤无转移，25例肿瘤有转移），应用流式细胞仪测定卵巢癌细胞DNA含量及其在细胞周期各相中的分布；应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及特异探针D₃对卵巢癌细胞进行DNA印渍杂交分析，并对杂交条带进行辉度扫描；应用银染聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术检测卵巢癌细胞p53基因突变，并与正常卵巢和良性卵巢肿瘤进行比较。结果：正常卵巢、良性卵巢肿瘤、卵巢癌无转移和有转移者CD44v6表达阳性率分别为0%、10%、75%、88%；而p53基因突变率分别为0%、5%、40%、60%，两者都呈逐渐上升趋势。CD44v6辉度扫描，卵巢癌无转移者（3 820±289）与有转移者（10 132±1 521）比较，差异有极显著性（P＜0.01）。卵巢癌CD44v6表达阳性和阴性患者中，G₂M期细胞平均值分别为5.90%和5.06%(P＞0.05)；异倍体细胞分别为57%和50%(P＞0.05)。而在p53基因有突变和无突变患者中，G₂M期细胞分别为11.15%和5.85%（P＜0.05）；异倍体细胞分别为74%和36%（P＜0.05）。结论：CD44v6表达与肿瘤转移密切相关，CD44v6表达和p53基因突变与肿瘤转移关系可能涉及不同的作用机理。CD44v6作为肿瘤转移标记可能比p53更好。

　　关键词：卵巢肿瘤　抗原，CD44　基因，p53　倍性　突变

　　细胞表面粘附分子在肿瘤发生发展中，尤其是在肿瘤转移中起着十分重要的作用。粘附分子CD44的变构体CD44v6只表达于发生转移或有转移能力的肿瘤细胞^［1-3］。近年来，随着对p53基因与肿瘤关系的深入研究，证实p53基因突变与肿瘤转移和染色体异倍性呈正相关， 已有文献证实了CD44v6表达先于p53基因突变^［4，5］。本研究使用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)/DNA印渍杂交分析方法和银染聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术检测卵巢癌肿瘤细胞中CD44v6表达和p53基因突变，以期探索卵巢癌CD44v6表达与p53基因突变、染色体倍性及卵巢癌转移之间的关系，为CD44在肿瘤细胞表面区分性表达的机理研究提供一定的理论依据。

　　资料与方法

　　一、研究对象

　　1. 临床资料： 选自1996年7月至1998年12月在上海第二医科大学附属瑞金医院妇产科住院手术的患者85例，年龄24～80岁。其中正常卵巢20例、良性卵巢肿瘤20例(单纯性卵巢囊肿2例、浆液性乳头状囊腺瘤8例、粘液性囊腺瘤5例、成熟畸胎瘤2例、子宫内膜样囊肿3例)、卵巢癌45例（无转移者20例，有转移者25例）。卵巢癌按国际妇产科联合会(FIGO)分期：临床Ⅰ期20例、Ⅱ期3例、Ⅲ期13例、Ⅳ期9例，其中，浆液性囊腺癌20例、粘液性囊腺癌8例、腺癌16例、未成熟畸胎瘤1例，病理类型以上皮类为主。

　　2. 标本处理： 取2 cm×2 cm大的新鲜肿瘤块，用Hanks液洗净后，剪碎成小块，置于5 ml Hanks液中，加入胶原蛋白酶Ⅱ(美国Sigma公司产品)至终浓度为200 U/ ml，于37℃消化3 h后通过手指尼龙膜过滤，收集细胞，经75％的淋巴细胞分离液分离，以2 000 r/min离心20 min后可得肿瘤细胞（经瑞氏染色确认）。将正常卵巢细胞、良性卵巢肿瘤细胞和卵巢癌细胞各分成3部分，分别用于抽提RNA、DNA以及进行肿瘤细胞DNA含量和细胞周期分布测定。

　　二、方法

　　1.肿瘤细胞DNA含量和细胞周期分布测定： 应用流式细胞仪测定肿瘤细胞DNA含量及细胞周期在各相中的分布，具体方法参照文献［6］。

　　2.RNA的抽提及cDNA的合成： 采用美国Life Tehnologies公司的Trizol RNA一步法抽提试剂抽提RNA，采用同一公司的Superscript^TM试剂盒Oligo(dT)_12-18引物合成cDNA，详见试剂盒操作步骤。

　　3.CD44分子PCR扩增的特异性引物序列：P₁为5′GACACATATTGCTTCAATGCTTCAGC 3′，P₂为 5′GATGCCAAGATGATCAGCCATTGTGGAAT 3′。反应体系总体积50 μl，其中20×PCR缓冲液2.5 μl、25 μmol/L氯化钠3.0 μl、10 μmol/L脱氧核苷三磷酸混合液1.0 μl、引物1.0 μl、耐热DNA聚合酶（1 U/μl）1.0 μl、cDNA模板2.0 μl、双蒸水39.5 μl。扩增条件为94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环。

　　4.探针标记和DNA印渍杂交： 探针S₁与标准型CD44分子结合，探针D₃与CD44v6变构体结合。两探针序列：S₁为5′CCTGAAGAAGATTGTACATCAT- CACAAC3′，D₃为5′TGAGATTGGGTTGAAGAAATC 3′，按美国Dupont NEN公司非放射性3′末端标记试剂盒标记S₁和D₃，并贮藏于-20℃冰箱保存。12 μl CD44扩增产物按美国Dupont NEN公司的操作手册进行电泳、转移至带正电荷尼龙膜上，D₃和S₁探针分别与同一张膜杂交，采用化学发光反应使X线摄片曝光。

　　5.CD44v6的定性分析和定量检测： 根据X线摄片上有无条带确定各标本CD44v6的表达情况，为CD44v6的定性分析；采用德国Kaiser公司的图象分析系统测定X线摄片上条带的辉度值，为CD44v6的定量分析。

　　6.p53基因突变的测定：采用银染PCR-SSCP方法测定。 取10 μl p53基因第5、6、7、8外显子的DNA扩增产物，按文献［7］处理，在8％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并对凝胶进行银染，最后真空干燥保存。

　　三、统计学分析

　　所获数据的各组间比较采用χ²检验和t检验。

　　结果

　　一、 CD44v6的定性、定量分析

　　正常卵巢、良性卵巢肿瘤、卵巢癌无转移和有转移者中均表达标准型CD44，且辉度值比较，差异无显著性（P＞0.05）。正常卵巢、良性卵巢肿瘤、卵巢癌无转移和有转移者中CD44v6表达阳性率分别为0%、10%、75%和88%，卵巢癌无转移和有转移者CD44v6表达阳性率比较，差异无显著性（P＞0.05）。但CD44v6的辉度值分别为85±23、817±126、3 820±289、10 132±1 521，卵巢癌有转移者较无转移者CD44v6表达量显著增加（P＜0.01），见图1，2。CD44分子在基因水平上由不同外显子拼接成不同分子量的CD44拼接体，杂交图谱上显示有许多条杂交带，每一条带含有标准型CD44或变构体CD44v6，均被探针S₁或D₃杂交显示。

1～7：7例卵巢癌有转移患者显示的条带图1　探针S₁与标准型CD44的DNA印渍杂交结果

1～7：7例卵巢癌有转移患者显示的条带图2　探针D₃与变构体CD44v6的DNA印渍杂交结果

　　二、 p53基因突变检测

　　20例正常卵巢中未见p53基因突变；20例良性卵巢肿瘤中p53基因突变1例，占5%; 20例无转移卵巢癌中p53基因突变8例，占40%；25例有转移卵巢癌中p53基因突变15例，占60%。p53基因突变，有转移卵巢癌与无转移卵巢癌比较，差异有显著性(P＜0.05)。见表1和图3。

表1　各类组织中p53基因突变情况

　　 ^* 突变数与第5、6、7、8外显子突变数之和不符合，是由于各有2例标本同时在2个外显子发生突变

1：正常卵巢　2：良性卵巢肿瘤　3～4：卵巢癌有转移者　5：卵巢癌无转移者　^*箭头所指表示有基因突变图3　银染PCR-SSCP检测p53基因突变结果

　　三、 细胞周期检测

　　37例CD44v6阳性卵巢癌标本中，G₂M期细胞平均占5.90%；8例CD44v6阴性卵巢癌标本中，G₂M期细胞平均占5.06%，两者比较，差异无显著性（P＞0.05）。23例p53基因突变的卵巢癌标本中，G₂M期细胞平均占11.15%；而22例p53基因未发生突变的卵巢癌标本中，G₂M期细胞平均占5.85%，两者比较，差异有显著性(P＜0.05)。

　　四、细胞DNA含量测定

　　45例卵巢癌标本中，二倍体细胞20例，其中6例发生转移，占30%；异倍体细胞25例，其中19例发生转移，占76%，两者比较，差异有极显著性（P＜0.01）。37例CD44v6阳性卵巢癌标本中，二倍体16例，异倍体21例，异倍体率57%；8例CD44v6阴性卵巢癌标本中，二倍体4例，异倍体4例，异倍体率为4/8，两者比较，差异无显著性（P＞0.05）。23例p53基因突变的卵巢癌细胞中有17例为异倍体，异倍体率74%，而22例p53基因未突变卵巢癌细胞中异倍体为8例，异倍体率36%，两者比较，差异有显著性(P＜0.05)。

　　讨论

　　一、 肿瘤转移与CD44v6表达及细胞异倍性的关系

　　本研究采用分子生物学技术对卵巢癌发生发展各期中的CD44v6表达、肿瘤转移和细胞异倍性进行研究。结果显示，CD44v6表达阳性率和其辉度值均证实了在分子水平上CD44v6与肿瘤转移是密切相关的。个别良性卵巢肿瘤标本也有CD44v6表达，提示CD44v6拼接体可出现在肿瘤发生、发展的早期阶段。另外，卵巢癌无转移者中CD44v6表达阳性率高，可能由于我们判断肿瘤是否发生转移主要依靠病理学分析的结果，无法排除已发生的极微量的转移或具有转移潜能的肿瘤细胞。要证实临床上无转移灶而CD44v6阳性的肿瘤细胞比CD44v6阴性的肿瘤细胞易于发生转移，需要进一步对患者跟踪随访。Barlogic等^［8］认为，非二倍体细胞肿瘤将更富有侵袭性，分化更低。王聆等^［9］曾首先发现人体大肠癌转移特性与DNA异倍性相联系。本研究中，异倍体细胞25例，其中19例发生转移，二倍体细胞20例，其中6例发生转移，进一步证实了王聆的观点。

　　二、 CD44v6表达和p53基因突变在肿瘤发生发展中的作用

　　有学者认为，CD44v6表达可能与肿瘤细胞增殖分化有关^［4，5］。Tanabe等^［10］认为，CD44v6高表达相当于给肿瘤细胞一个特定的“邮政编码”，为其在转移中的识别、迁移和定居方向提出指令，使之易于穿越淋巴结，发生远处转移，CD44v6可能行使一种“配体引导的多向性行为”。本研究的结果显示，CD44v6表达与细胞的增殖分化和染色体倍性都无关，因此我们认为，CD44v6可能不是通过增加肿瘤细胞增殖分化而参与肿瘤发生发展的。1992年，Lane^［11］提出p53蛋白抑癌机理的“分子警察”模式。本研究通过银染PCR-SSCP方法检测卵巢癌细胞p53基因突变，并结合流式细胞仪检测细胞周期分布，结果发现，p53基因突变引起细胞增殖旺盛，进入G₂M期的细胞增加，23例p53基因突变的卵巢癌G₂M期细胞平均占11.15%，22例p53基因未突变的卵巢癌G₂M期细胞平均占5.85%，因此，初步证实了Lane提出的p53基因参与肿瘤发生发展的机理。

　　三、p53基因突变与肿瘤形成的关系

　　p53基因突变引起的抑制肿瘤功能的失活是导致部分肿瘤形成的关键性机理之一。本研究显示，卵巢癌有转移患者的p53基因突变率为60%，而无转移的卵巢癌患者为40%，与国外文献报道一致，说明p53基因的突变与肿瘤转移有着很重要的关系。野生型p53基因正常功能之一是维持细胞DNA的完整性，一旦DNA发生损伤和变异，p53蛋白能迅速聚集促使DNA在增殖前完成修复，但突变型p53基因产物却丧失此项功能导致DNA异倍体的产生^{［12，13］}。本研究中，23例p53基因突变的卵巢癌标本中17例是异倍体，达74%，而22例p53基因未突变的卵巢癌标本中异倍体8例，达36%。

　　四、 CD44v6与p53基因的比较

　　已有文献证实，CD44v6表达先于p53基因及ras基因的突变^［5］。本研究结果显示，随着肿瘤的不断发生发展，p53基因突变率和CD44v6表达量逐渐增加，这与Mulder等^［14］的结果一致，且CD44v6表达的阳性率高于p53基因突变率。目前，国内外已有学者把突变的p53基因当作肿瘤标记来检测肿瘤。本研究结果提示，与p53基因突变比较，CD44v6可能是更好的肿瘤转移标记，CD44v6的检测可为肿瘤转移、术后残留灶检测、预后判断等提供良好的依据。

　　作者单位：孙　宜（上海第二医科大学附属上海瑞金医院妇产科200025)

　　 季晓琼（上海第二医科大学附属上海瑞金医院妇产科200025)

　　 沈仲毅（上海第二医科大学上海市免疫学研究所）

　　参考文献

　　1 Gunthert U, Hofmann M, Rudy W, et al. A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells. Cell, 1991, 65:13-24.

　　2 Rosanelli GP，Steindorfer P, Wirnsberger GH, et al. Mutant p53 expression and DNA analysis in human breast cancer comparison with conventional clinicopathological parameters. Anticancer Res, 1995, 15:581-586.

　　3 Harn HJ, Ho LI, Yu CP, et al. The variant mRNA isoform of human metastasis gene (CD44v) detected in the cell lines of human hepatocellular carcinoma. Biochem Mol Biol Int, 1994, 32:233-238.

　　4 Kim H, Yang XL, Rosada C, et al. CD44 expression in colorectal adenomas is an early event occurring prior to K-ras and p53 gene mutation. Arch of Biochem Biophys, 1994, 310:504-507.

　　5 East JA, Hart IR. CD44 and its role in tumour progression and metastasis. Eur J Cancer, 1993, 29A:1921-1922.

　　6 沈仲毅，欧启水，沈天伟，等. p53基因突变及染色体倍性与大肠癌转移之间关系初探. 肿瘤杂志， 1998，18:145-148.

　　7 欧启水，王灏，沈仲毅，等. 银染PCR-SSCP检测大肠癌p53基因突变. 中国实验诊断学杂志，1997，1:35-37.

　　8 Barlogic B, Rber MN, Schumann J, et al. Flow cytometry in clinical cancer research. Cancer Res, 1983,43:3982-3997.

　　9 王聆，臧人杰，周光炎. 人类大肠癌不同倍性细胞HLA抗原表达格局的差异及其与转移的关系. 中华肿瘤杂志，1992，14:175-177.

　　10 Tanabe KK, Ellis LM, Saya H. Expression of CD44R1 adhesion molecule in colon carcinomas and metastasis. Lancet, 1993, 341:725-726.

　　11Lane DP. Cancer. p53， guardian of the genome. Nature, 1992, 358:15-16.

　　12 Hirotoshi H, Masakazu U, Kazuo F, et al. p53 gene mutations in early colorectal cacinoma, de novo vs adenoma-carcinoma sequence. Int J Cancer, 1991, 64:47-51.

　　13 DiGiuseppe JA, Hruban RH, Goodman SN, et al. Over expression of p53 protein in adenocarcinoma of the pancreas. Am J Clin Pathol, 1994, 101:684-688.

　　14 Mulder JW, Wielenga VJ, Polck MM, et al. Expression of mutant p53 protein and CD44 variant proteins in colorectal tumorigenesis. Gut, 1995, 36:76-80.