肿瘤转移抑制基因nm23-H1 mRNA在人卵巢癌中的表达

　　第二军医大学学报1999年第20卷第10期

　　周晓宁　陈晓东　王昭梅　沙金燕　崔英　顾青　姜海燕

　　摘　要　目的：通过检测人卵巢癌标本中肿瘤转移抑制基因nm23-H1 mRNA的表达，了解其临床意义及其与预后的关系。方法：应用原位杂交技术检测43例人卵巢癌标本中nm23-H1 mRNA的表达水平。结果：nm23-H1 mRNA表达水平与卵巢癌的病理组织学类型无关（P＞0.05）；与患者术时有淋巴结或大网膜转移呈负相关（P＜0.05）；且转移灶的阳性表达率低于原发灶（P＜0.05）。 结论：nm23-H1基因在人卵巢癌的扩散和转移过程中可能发挥着抑制作用，它在卵巢癌组织中的表达水平具有重要的临床意义。

　　关键词：卵巢肿瘤　肿瘤转移抑制基因　原位杂交

　　卵巢癌的发病率近年不断上升，多数患者就诊时就已有腹腔内播散或远处脏器的转移，仅约20%的患者肿瘤尚局限在盆腔。而对卵巢肿瘤发生转移的机制及其相关基因和分子水平的变化，目前所知甚少。nm23基因是近年来颇受重视的肿瘤转移抑制基因，是1988年首次从鼠黑素瘤K-1735细胞株中分离得到，它在低转移细胞株中的表达强度约为高转移细胞株的10倍。研究发现，在人基因组中存在着两个nm23基因：nm23-H1基因和nm23-H2基因，它们均编码17 kd的蛋白质，其中nm23-H1基因的表达水平与肿瘤转移的关系更为密切^［1］。研究结果证实，在人乳腺癌、肝癌、胃癌、恶性黑素瘤等肿瘤组织中，nm23-H1基因的表达降低与转移发生和预后差密切相关。本实验对43例人卵巢癌组织中nm23-H1 基因的mRNA进行了原位检测，旨在分析nm23-H1 基因与卵巢癌转移的相关性，希望为临床治疗方案的选择及患者预后判断提供客观依据。

　　1　材料和方法

　　1.1　标本　共采用43例人卵巢癌标本，根据FIGO卵巢恶性肿瘤分期标准（1985年），Ⅰ～Ⅱ期16例，取其原发灶标本；Ⅲ～Ⅳ期27例，分别取其原发灶和淋巴结或网膜转移灶标本。所有标本均于组织离体后0.5 h内无菌采集，置4%多聚甲醛PBS（pH 7.4）固定1 h，置15%蔗糖PBS漂洗4～5 h，即行冰冻切片，切片厚约15 μm，载玻片预先经严格处理灭活RNA酶，然后涂布铬矾明胶（0.01%铬矾，0.1%明胶）。

　　1.2　制备cRNA探针　nm23-H1 cDNA由美国Rosengard博士转赠。测序结果与报道相符。载体质粒为PGEM-4Z。经限制酶HindⅢ或SmaⅠ酶切线性化后作为模板分别合成反义和正义探针。用地高辛RNA标记试剂盒（DIG-RNA Labeling Kit, Boehringer Mannheim公司）标记探针。每次标记加入线性化模板1 μg，新合成的标记cRNA探针约10 μg。反义cRNA探针全长约971 bp，其中编码区732 bp，5′端非编码区144 bp，3′端非编码区约95 bp。

　　1.3　原位杂交　原位杂交操作流程按常规稍加改良进行。冰冻切片冷风稍吹干，用4%多聚甲醛PBS（pH 7.4）4℃固定30 min，37℃烤片12 h，依次用PBS，TritonX-100PBS洗脱；蛋白酶K消化，37℃ 30 min；消化后再用4%多聚甲醛PBS固定10 min；PBS，0.25%乙酸酐和2×SSC洗后进行杂交。杂交液成分为：50%去离子甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，5×SSC ，5× Denhardt液，2% SDS, 100 μg/ml变性的鲱精DNA，2～4 μg/ml nm23-H1反义cRNA探针。每张切片加25 μl杂交液，盖石蜡膜；杂交温度设置在50～55℃，12～16 h。梯度洗脱液洗（4×SSC，2×SSC，1×SSC，0.5×SSC，0.05 mol/L PBS）；加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体Fab片段（Boehringer Mannheim公司）1∶500稀释，25℃ 4 h；PBS洗；洗脱液Ⅰ（含100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；100 mmol/L NaCl；50 mmol/L MgCl₂）和洗脱液Ⅱ（含100 mmol/L Tris-HCl, pH 9.5;100 mmol/L NaCl；50 mmol/L MgCl₂）洗后显色；显色液用洗脱液Ⅱ新鲜配制，含NBT 400 mg/ml，BICP 200 mg/ml，每张切片加40 μl，25℃避光显色。每隔1 h观察颜色反应。用PBS洗终止显色反应。经100%乙醇，二甲苯处理后，中性树胶封片，避光保存。

　　1.4　对照设置　阴性对照：(1) 杂交前用RNase 100 μg/ml，37℃ 1 h预处理组织切片；(2) 用nm23-H1正义cRNA探针代替nm23-H1反义cRNA探针；(3) 用不含nm23-H1反义cRNA探针的预杂交液进行杂交反应。阳性对照：用已知表达nm23-H1 mRNA的人肝癌组织切片进行杂交反应，结果为阳性。

　　1.5　统计学处理　用χ²检验判定差异显著性。

　　2　结　果

　　2.1　结果判定　原位杂交染色显示nm23-H1 mRNA阳性产物定位于胞质内，为蓝色颗粒或团块(图1)。

1　卵巢癌nm23-H1 mRNA原位杂交染色结果

　　Fig 1　Results of nm23-H1 mRNA in situ hybridization stain in ovarian carcinoma

　　A:Positive×100; B:Positive×200

　　2.2　nm23-H1 mRNA表达与不同组织学类型卵巢癌的关系　43例卵巢癌原发灶标本中，浆液性囊腺癌20例， 阳性染色7例， 阳性率35.0%；粘液性囊腺癌9例，阳性染色5例，阳性率55.6%；低分化腺癌8例，阳性染色3例，阳性率37.5%；子宫内膜样腺癌6例，阳性染色3例，阳性率50.0%。各组织学类型间nm23-H1 mRNA的阳性表达率，经统计学处理，相差不显著（P＞0.05）。

　　2.3　nm23-H1 mRNA表达与卵巢癌有否淋巴结和网膜转移的关系　43例原发灶标本中，有淋巴结网膜转移的26例，阳性染色7例，阳性率26.9%；无转移者17例，阳性染色11例，阳性率64.7%。两者nm23-H1 mRNA 的阳性表达率，经统计学处理，相差显著（P＜0.05），nm23-H1 mRNA 的阳性表达率与卵巢癌发生转移呈负相关。

　　2.4　卵巢癌原发灶、转移灶间nm23-H1 mRNA 表达的关系　26例术时有淋巴结网膜转移的患者，原发灶阳性染色7例，阳性率26.9%；转移灶阳性染色1例，阳性率3.9%。两组间nm23-H1 mRNA的阳性表达率，经统计学处理，相差显著（P＜0.05）。

　　3　讨　论

　　nm23基因发现后，国内外学者从多个角度对其进行了深入的研究，结果显示，该基因编码蛋白质的生化性质、结构功能都与肿瘤转移密切相关。nm23基因作为转移抑制基因，已被多数学者所接受。本实验的结果也提示，在人卵巢癌组织中，nm23-H1 mRNA的表达水平与卵巢癌发生淋巴结网膜转移呈负相关，且原发灶的nm23-H1 mRNA 水平高于转移灶，与多数文献报道相符^［2～6］ 。本实验结果还发现，nm23-H1 mRNA水平与卵巢癌的组织学类型无关，这与部分学者的研究结果一致^［7，8］。Scambia等曾从分子和蛋白质水平研究了106例原发性卵巢癌患者的nm23基因，发现在无淋巴结转移的患者中，nm23-H1阳性率较高，且阳性患者中对化疗反应性佳的比例也较高，其5年生存率亦明显高于nm23-H1阴性者，认为nm23-H1含量测定对临床上治疗选择及预后判断具有重要的指导意义。目前在nm23基因与卵巢癌的相关性研究中的结论尚不一致，但多数学者支持nm23基因在卵巢癌中具有转移抑制作用和nm23-H1作为肿瘤转移抑制基因的假说。本研究结果亦显示，nm23-H1基因在人卵巢癌转移过程中发挥着抑制作用，它在卵巢癌组织中的表达水平有重要的临床意义，可望为患者的治疗选择及预后判断提供客观的实验依据。

　　文章编号：0258-879X(1999)10-0743-03

　　作者单位：第二军医大学长海医院妇产科，上海，200433；

　　陈晓东：广州军区广州总医院病理科

　　 参考文献

　　1　Steeg PS, Bevilacqua G, Kopper L, et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential［J］. J Natl Cancer Inst, 1988, 80(3): 200

　　2　Viel A, Agnese LD, Canzonieri V, et al. Suppressive role of the metastasis-related nm23-H1 gene in human ovarian carcinomas: association of high messenger RNA expression with lack of lymph node metastasis［J］. Cancer Res, 1995, 55(15): 2645

　　3　Mandai M, Konishi I, Komatsu T, et al. Mutation of the nm23 gene, loss of heterozygosity at the nm23 locus and K-ras mutation in ovarian carcinoma: correlation with tumour progression and nm23 gene expression［J］. Br J Cancer,1995, 72(3): 691

　　4　Mandai M, Konishi I, Koshiyama M, et al. Expression of metastasis-related nm23-H1 and nm23-H2 genes in ovarian carcinomas: correlation with clinicopathology, EGFR, c-erbB-2, and c-erbB-3 genes, and sex steroid receptor expression［J］. Cancer Res,1994, 54(7): 1825

　　5　Scambia G, Ferrandina G, Marone M, et al. nm23 in ovarian cancer: correlation with clinical outcome and other clinicopathologic and biochemical prognostic parameters［J］. J Clin Oncol,1996, 14(2): 334

　　6　吴晓华，蔡树模，张志毅，等.卵巢肿瘤中癌基因nm23-H1,c-erbB-2,ras和P53的蛋白表达与腹膜后淋巴结转移关系的研究［J］. 肿瘤， 1997,17(3)：134

　　7　Harlozinska A, Bar JK, Gerber J. nm23 expression in tissue sections and tumor effusion cells of ovarian neoplasms［J］. Int J Cancer. 1996,69(5): 415