增生性瘢痕组织中成纤维细胞活性功能研究△
中国修复重建外科杂志 1998年第2期第12卷 实验研究
作者：赵烨德1 牛星焘1 肖军军2
单位：1 北京医科大学附属第三医院成形科(北京，100083)；2 北京医科大学基础部细胞生物教研室
关键词：增生性瘢痕；成纤维细胞；细胞核增殖抗原
摘 要 为全面系统了解瘢痕增生过程中成纤维细胞的活性功能状况，实验通过40例不同时期的瘢痕增生组织进行成纤维细胞核内增殖抗原(PCNA)、核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)和氨基酸分析检测。结果发现：PCNA的蛋白表达主要在1和3个月时期的瘢痕成纤维细胞核内，细胞内AgNORs在1个月～9个月瘢痕增生组织中明显高于12个月以后的瘢痕组织及正常皮肤内水平；组织总氨基酸量随瘢痕增生发展逐渐递增，但以瘢痕增生1个月时期为最快(206.74 μg/mg组织)，代表胶原含量的羟脯氨酸则在瘢痕发展3个月～6个月之间提高最快(17.05 μg/mg组织)，6个月～9个月之间下降为5.11 μg/mg组织，9个月～12个月为1.31 μg/mg组织。由此提示：在瘢痕发展整个过程中，成纤维细胞的增殖旺盛阶段在瘢痕形成早期，胶原蛋白沉积在6个月时期左右也基本完成，但其它细胞外间质如胶原蛋白，蛋白多糖纤维结合蛋白等在12个月以后的瘢痕组织中仍有聚集。
STUDY ON THE ACTIVITY OF FIBROBLAST IN HYPERTROPHIC SCAR/Zhao Yede, Niu Xingtao, Xiao Junjun. Department of Plastic Surgery, the Third Affiliated Hospital of Beijing Medical University, Beijin, P. R. China 100083
Abstract To determine the state of fibroblast during the process of development of hypertrophic scar (HS), 40 specimens of HS in different periods were collected. The expressions of prolifrating cell nuclear antigen (PCNA) and Ag-protein in nucleolar organizer regions (Ag NORs) as well as the content of total amino acids in the tissues were examined. The hypertrophic scar of 1st and 3rd month old, the expression of PCND and Ag NORs were the highest. In the 9th and 12th month old, althrough PCNA was nearly negative, but the expression of Ag NORs was low. The content of total amino acid was increased gradually as HS developed but the increase of amount of hydroxyproline was markedly slowed down in 9 month old HS. It was suggested that: (1) in the developing process of HS the proecess of overproliferation of fibroblasts was short and limitted in 1-3 months period in the process of wound lealing; (2) the synthesis of collagen was nearly stopped at 6 months, but that of other extracellular matrix such as fibronectin and proteoglycan might be continued to aggregate after 12 months.
Key words Hypertrophic scar Fibroblast Proliferating cell nuclear antigen
成纤维细胞作为导致增生性瘢痕组织病理学改变的主要角色，一直是人们研究的热点。在以前的实验研究中，我们已经发现瘢痕组织内免疫细胞的过度浸润，细胞因子的表达与组织增生发展有着密切的联系。为进一步明确细胞因子的作用，并全面了解成纤维细胞的活性功能，选择不同时期增生性瘢痕组织40例，进行成纤维细胞核内增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和核仁组成区嗜银蛋白(Ag-protein in nucleolar organizer regoins, AgNORs)表达检测；组织内羟脯氨酸及总氨基酸含量分析。报道如下。
1 材料与方法
1.1 组织来源
增生性瘢痕组织40例，其中增生1个月6例，3个月6例，6个月8例，9个月7例，12个月13例；正常皮肤组织6例。标本均取自北京医科大学附属第三医院成形科住院患者，年龄20岁～40岁。取材前患者无长期外用瘢痕防治药物史，不伴肿瘤及其它严重疾患。
1.2 主要试剂及配制
鼠抗人PCNA单克隆抗体，SP试剂盒购自北京中山生物公司； 酸化液： 1份36%乙酸和3份无水乙醇混合物；工作液Ⅰ：2g明胶溶于1%甲酸液中；工作液Ⅱ：50%硝酸银液；定影液：5%硫代硫酸钠液。
1.3 方法
1.3.1 PCNA蛋白检测 液氮保存组织标本，在恒温冷冻切片机上制成5 μm～10 μm冰冻切片，载玻片须先用APES脱片剂处理，组织切片4%多聚甲醛固定20分钟，PBS清洗3%，H2O 10分钟，二抗血清37℃ 20分钟，1∶200 PCNA单抗37℃ 1小时，二抗及SP复合物37℃各45分钟，DAB加1%AgNO3 5分钟，脱水，透明，封片观察。
1.3.2 AgNO3检测 4 μm石蜡组织切片脱蜡至去离子水5分钟3次；酸化液5分钟，去离子水重复3次各5分钟，银染；工作液Ⅰ和工作液Ⅱ按1∶2比例临用前混合，滴于切片上，30分钟，避光，去离子水洗；定形；5%硫代硫酸钠2分钟，水洗，脱水，透明，封片观察。
1.3.3 氨基酸分析 新鲜组织标本60℃烘烤24小时～48小时，干燥后标量，置18 mm×180 mm试管中，加6mol/L HCl 0.5 ml/mg组织；充氮，封口，110℃水解20小时～24小时，冷却，氧化二磷干燥，再准确加0.2 mol/L HCl至1 ml，上样于氨基酸分析仪中，自动测定。
2 结果
2.1 PCNA
PCNA最早是从SLE血清中为自身抗体所识别的见于增殖核内的抗体成份得以认识的；观察证明，PCNA与细胞周期是同一物质，在功能上属于DNA聚合酶辅蛋白，在细胞周期调节中具有重要作用。我们利用PCNA单抗作PCNA表达免疫组化检测，为增加反应对比度，在DAB显色剂中加入1% AgNO3，阳性信号呈黑色。结果显示：1个月～3个月瘢痕增生组织的成纤维细胞核内可见高密度黑色阳性信号；6个月时期的瘢痕组织中，在胶原结节内的成纤维细胞内表达弱，而胶原结节间隙中的成纤维细胞核内仍有较强表达；12个月以后瘢痕及正常皮肤的成纤维细胞内PCNA表达均很弱(图1 a，b)。
2.2 AgNORs
实验通过带负电荷的羧基，银离子与嗜银蛋白相互结合，使银离子还原成金属银，形成在亚显微镜下看得见的微小核心，并以此作为银继续沉淀的集中部位，然后由较少负电荷的硫氢基吸引银，使微小银发展成特征性黑点。实验发现，在不同时期瘢痕组织及正常皮肤标本中，均有大小不等，密度不均的黑点信号(图2，3)。借助计算机图像处理系统，测得成纤维细胞核内平均银染灰度值见表1。
统计结果表明：在增生性瘢痕发展过程中，AgNORs在1个月～9个月时期明显高于12个月时期及正常皮肤内含量，在1个月～9个月之间，1，3个月时期又明显高于6，9个月时期(P＜0.01)，但1个月与3个月，6个月与9个月，12个月与正常皮肤之间AgNORs量无显著差异(P＞0.05)。
2.3 氨基酸分析
每例标本必须彻底烘干，精确称量，其中重量最好不超过5 mg，必要时分成几小块，各期瘢痕组织及正常皮肤通过氨基酸自动分析仪测得羟脯氨酸及总氨基酸量，结果如表2所示。可见随增生性瘢痕发展，羟脯氨酸及总氨基酸在组织内有不同程度升高，各期之间作组织t检验表明，羟脯氨酸量在9个月与12个月瘢痕组织之间无显著性差异，其余各组间差异明显(P＜0.01)，而总氨基酸量在各组间均有显著差异(表3)。
图1 免疫组化染色标记的PCNA(×100)
a 1个月的瘢痕 b 6个月的瘢痕
图2 组织化学染色标记的AgNORs(×400)
a 1个月的瘢痕 b 3个月的瘢痕
图3 组织化学染色标记的AgNORs(×400)
a 9个月的瘢痕 b 12个月的瘢痕
表1 各时期组成纤维细胞AgNORs的光密度(
)±s)
| 正常皮肤 |
1个月 |
3个月 |
6个月 |
9个月 |
12个月 |
| 0.297 5±0.039 1 |
0.392 4±0.028 0 |
0.397 6±0.087 1 |
0.358 2±0.034 0 |
0.358 3±0.038 5 |
0.300 5±0.032 8 |
表2 正常皮肤及各期瘢痕组织的羟脯氨酸和总氨基酸水平(μg/mg，±s)
| |
正常皮肤 |
1个月 |
3个月 |
6个月 |
9个月 |
12个月 |
| 羟脯氨酸 |
43.67± 1.71 |
54.41± 2.23 |
67.53± 3.02 |
84.58± 2.36 |
89.69± 4.20 |
91.00± 1.84 |
| 总氨基酸 |
548.34±12.40 |
755.08±14.51 |
837.97±13.09 |
893.16±19.60 |
956.95±13.87 |
986.51±17.85 |
表3 相应连续时间点之间羟脯氨酸和总氨基酸的增加量(μg/mg)
| 月 |
羟脯氨酸 |
总氨基酸 |
| 正常～1 |
10.74 |
206.74 |
| 1～3 |
13.12 |
82.89 |
| 3～6 |
17.05 |
55.19 |
| 6～9 |
5.11 |
63.79 |
| 9～12 |
1.31 |
29.56 |
3 讨论
成纤维细胞活性功能在增生性瘢痕发生、发展过程中具有重要的作用。成纤维细胞的活性功能包括增殖分化功能和细胞外基质的合成、分泌功能。从目前所能查阅的文献中，我们还没有发现定为测定瘢痕组织中成纤维细胞增殖活性的方法。众所周知，在细胞周期中，一些蛋白质的合成对于细胞由G0/G1期进入S期(DNA合成期)是必不可少的，如降钙素、非组蛋白、染色体蛋白和PCNA等。PCNA又称周期蛋白(cyclin)，首先由Miyachi提纯［1］。研究表明，PCNA本质是一种DNA聚合酶的附属蛋白，它的出现明显与细胞增殖有关，在静止细胞，其量很少，G1晚期开始增加，S期达到高峰，G2、M期明显下降［2，3］。目前，PCNA已成为了解细胞增殖活性状态的重要指标。我们的实验结果表明，在1和3个月增生性瘢痕组织中PCNA表达率最高，6个月时期组织内PCNA表达大多集中于皮下浅层及胶原结节间隙的成纤维细胞核内，以后组织内表达明显下降。正常皮肤组织的PCNA表达仅存在于部分基底细胞核内。说明，在早期组织中成纤维细胞处于旺盛增殖时期，6个月时期开始下降，9个月以后瘢痕中成纤维细胞几乎不再增殖。至于早期瘢痕组织中成纤维细胞大量增殖的原因，我们认为与免疫细胞的过度及IL-1β、TGF-β的过度表达有关。
成纤维细胞对增生性瘢痕形成的另一大“贡献”就是分泌大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)。ECM成分包括不同类型胶原蛋白、各种蛋白多糖、弹性蛋白以及一些粘连蛋白［4，5］。但在增生性瘢痕组织中ECM主要是胶原蛋白、蛋白多糖和纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)。对瘢痕组织ECM的研究以往很少见到有系统的报道，我们通过氨基酸分析仪，测定各时期组织内细胞外基质蛋白和细胞结构蛋白经特殊处理后降解为游离氨基酸的含量。结果发现，绝大部分游离氨基酸含量随瘢痕发展逐渐增加，氨基酸总量也呈不同程度的升高。游离氨基酸中的羟脯氨酸，作为胶原蛋白的特异性氨基酸，其含量具有间接反映胶原含量的作用。因此，每一时期的羟脯氨酸量可反映出此时胶原的沉积状况，各时期之间的羟脯氨酸升高量就大致代表胶原蛋白新合成和分泌的量。羟脯氨酸在6个月以前各期之间升高比较稳定，其中以3个月～6个月之间升高最明显(17.05 μg/mg组织)，说明3个月～6个月为胶原合成的高峰期；6个月～9个月时期升高幅度则明显下降(5.11 μg/mg组织)，9个月～12个月之间平均只升高1.31 μg/mg组织。统计结果进一步表明，6个月和9个月时期的羟脯氨酸量两者有显著性差异，而9个月与12个月时期两者的羟脯氨酸量则无显著性差异。说明在瘢痕发展整个过程中，成纤维细胞合成和分泌胶原蛋白的能力于6个月以前为最强，胶原在组织中沉积基本上至9个月时期已完成。
总氨基酸量反应了组织内蛋白质含量。组织内蛋白质包括组成细胞的结构蛋白和细胞外基质蛋白，从我们的实验结果中可以看出，1个月时期组织内总氨基酸量与正常皮肤相比，平均升高206.74 μg/mg组织，幅度最大；3个月～6个月之间升高了55.19 μg；而6个月～9个月之间则升高了63.79 μg。值得注意的是，在细胞增殖和胶原合成研究中我们已经证实：成纤维细胞在6个月以后的增殖能力明显低于6个月以前，胶原新合成量由3个月～6个月的17.05 μg下降至5.11 μg，但氨基酸总量却为何出现“反弹”现象呢?而且在9个月～12个月时期仍有29.56 μg/mg组织的增加量。我们认为，尽管6个月以后瘢痕组织内成纤维细胞合成胶原蛋白的能力明显下降，但其它细胞外基质如蛋白多糖、FN等仍有可能在不断合成分泌，从而导致组织总氨基酸含量的升高。至于1个月时期大幅度升高原因，一方面与组织内大量细胞外基质沉积有关，但更主要的是伤后有大量成纤维细胞增殖造成细胞结构蛋白含量明显增加。
为了进一步证实在6个月以后的瘢痕组织内成纤维细胞仍具有分泌大量细胞外基质蛋白的能力，我们利用AgNORs的特点，研究细胞增殖、蛋白质的合成能力。核仁组成区(nucleolar organizer regions, NORs)是DNA的袢，它具有核糖体RNA基因，而AgNORs是核仁组成区上的嗜银非组蛋白［6，7］。NORs是DNA转录的调节者，并维持DNA呈伸展状态，它的数量和大小反应诱导分化的能力及NORs的转录活性［8，9］。理论上，人类二倍体细胞的核DNA合成以后，应该显示20对AgNORs的位置，但它们能否检查出来取决于NORs的转录活性，该型携带NORs的染色体数量以及细胞所处的周期阶段，但AgNORs的增加又与细胞增殖或蛋白转录活性有关。由于我们采用的标本为组织切片，实验结果反映的AgNORs不能完全代表核内AgNORs数量，因此为排除系统误差，我们借助图像分析检测相同时期成纤维细胞平均银染面积的光密度值。从表1中不难看出各个时期细胞的AgNORs量均高于正常皮肤组织中的量，但只有12个月时期组与正常皮肤组无显著性差异(P＞0.05)。各时期组之间比较发现，1个月组与3个月组，6个月组与9个月组之间二者均无显著性差异，3个月组与6个月组，9个月组与12个月组之间又有显著性差异。我们认为，3个月～6个月之间的差异可能与细胞增殖有所下降有关，6个月～9个月之间无显著差异，说明成纤维细胞尽管增殖功能下降，但蛋白转录功能无明显改变，说明在9个月时期瘢痕组织内成纤维细胞仍有较强的蛋白合成能力，这无疑使细胞外基质进一步得以沉积，组织内氨基酸总量也随之升高。因此，细胞外基质沉积是一个长时间聚积过程。
4 参考文献
1 Miyach K, Frizier MJ, Tan EM. Autoantibodies to a nuclear antigen in proliferating cell. J Immunol, 1987;121(6):2228
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3 Rodrgo B, Heather MB. Existence of two population of cyclin/proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle: Association with DNA replication site. J Cell Biol, 1987;105(4):1549
4 李 玉主编．细胞外间质的生物化学及研究方法．北京：人民卫生出版社，1988：147～148
5 Rockwell WB, Cohen IK, Ehrlich HP et al. Keloid and hypertrophic scars: A comprehensive review. Plast Reconstr Surg, 1989;84(5):827
6 Ploton D. Improvenent if the staining and in the visualization of the argyrophilic protein of the nucleolar organizer region at the optical level. Histochem J, 1986;18(1):5
7 William MA, Turgen AK, Krohne G et al. Argyrophilic nuclear and nucleolar protein of xenopus laevis oocytes identified by gel electrophresis. Exp Cell Res, 1982;137:341
8 Crocker J. Nucleolar organizer regions in lymphomas. J Pathol, 1988;154(2):151
9 Egam M, Rafat F, Crocker J et al. Prognostic importance of nucleolar organizer regions in ewing s scarcoma of childhood. J Clin Pathol, 1988;41(2):232
△ 国家自然科学基金资助项目
（收稿：1997-04-07）
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