透明质酸刺激因子对成纤维细胞活性功能和胶原合成的影响

中华整形烧伤外科杂志 1999年第2期第15卷 创面愈合

作者：王强　鲁开化　杨力　艾玉峰　蒋永培

单位：710032　西安，第四军医大学西京医院整形外科中心(王强现在潍坊, 解放军第八十九医院，261021)

　　关键词： 透明质酸刺激因子；成纤维细胞；透明质酸；嗜银蛋白；胶原

　　【摘要】　目的　研究透明质酸刺激因子(HASF)对正常皮肤及瘢痕成纤维细胞活性和胶原合成的影响。方法　层析法从兔羊水及胎兔血清中提取HASF并做活性鉴定；用嗜银蛋白(AgNORs)染色法、³H-脯氨酸掺入法和羟脯氨酸(HYP)测定法观察不同浓度的HASF对细胞增殖活性和胶原蛋白合成的影响。结果　HASF使两类细胞的AgNORs含量减少；两类细胞实验组脯氨酸掺入率与HYP含量均较对照组低，两种胶原测定法相关性好。结论　HASF对正常皮肤及瘢痕成纤维细胞的活性功能及胶原合成有抑制作用，可能影响伤口愈合中瘢痕的形成。

　　Effects of hyaluronic acid-stimulating factor on viability and collagen synthesis of fibroblasts

WANG Qiang^*, LU Kaihua, YANG Li, et al.

　　Plastic Surgery Genter, Xijing Hospital, Xi'an 710032

　　【Abstract】Objective To study the effects of hyaluronic acid-stimulating factor(HASF) on viability and collagen synthesis of fibroblasts derived from human dermis and scars.Methods HASF was purified from amniotic fluid and fetal serum of gestational rabbits, and its activity was determined. To observe the effects of HASF on viability and collagen synthesis of two cell lines, AgNORs staining, ³H-proline incorporation and HYP determination were carried out.Results HASF reduces AgNORs contents in skin FB and scar FB; ³H-proline incorporation and HYP contents were lower in experimental groups than those in controls in both cell lines. Two methods to detect collagen correlate well with each other.Conclusion HASF inhabits viability and collagen synthesis of both cell lines, thus may interefred with the formation of scar during wound healing.

　　【Key words】 Hyaluronic acid-stimulating factor Fibroblast Hyaluronic-acid Argyrophilic protein Collagen

　　在瘢痕机理的研究中，有学者发现一种分子量150 000的糖蛋白能刺激体外培养的成纤维细胞(FB)产生高浓度透明质酸(HA)，称为透明质酸刺激因子(HASF)。HASF参与创伤愈合过程，是导致胚胎伤口无瘢痕修复的重要因素之一^［1］，而瘢痕的形成主要是FB与细胞外基质尤其是胶原成分相互作用的结果。我们从孕兔羊水及胎兔血清中提取了HASF，将其用于体外培养的正常皮肤及瘢痕FB，观察了HASF对FB生物学活性及胶原合成的影响。

　　1　材料和方法

　　1.1　主要仪器与试剂　SephadexG-25(华美生物工程公司)，ConA-Sepharose(Pharmacia),DE-52(Whatman),HA放免测定盒，α-D甘露糖苷(上海试剂二厂)，50%硝酸银，β-氨基丙腈(Sigma),³H-脯氨酸(原子能研究院)，羟脯氨酸标准品(华美生物工程公司)。

　　1.2　FB的培养　细胞组织来源：正常皮肤取自25～42岁成人面颈部，男5例，女6例；瘢痕取自23～40岁成人面颈胸部，男6例，女4例，标本均修除表皮及皮下组织。

　　参照文献［2］用组织块法进行FB原代培养，正常FB及瘢痕FB分别在3～4周、5～7周长成单层，常规消化、传代，实验选用4～12代细胞。

　　1.3　HASF的提取及活性鉴定　妊娠20～25天新西兰兔，取羊水和胎兔血清混合，将样品依次过Sephadex G-25、ConA-Sepharose和DE-52柱，即获得HASF溶液^［3］，比色法测得蛋白含量为60mg/L，-20℃保存备用。

　　以正常皮肤FB为鉴定细胞，取对数生长期细胞，胰酶消化，以DMEM调整细胞浓度为1×10⁸个/L，按表1分组加样，接种于24孔板，每剂量组6孔，7天后用放免法检测上清中HA含量。

表1　HASF活性鉴定的加样表(μl)

　　Tab 1 Volumes of ingredients for HASF identification (μl)

　　1.4　细胞的AgNORs分析　用去离子水配制50%硝酸银溶液，20%明胶甲酸溶液，二者按体积1∶2配成染色液。取对数生长期的正常FB及瘢痕FB，以1×10⁴/0.25ml的浓度接种于24孔板，每孔预先放置等大的盖玻片，两种细胞均各设对照组(C组)和四个实验组(T₁～T₄组)，C组不加HASF，各实验组加入不同体积的HASF的提取液，使T₁～T₄组HASF终浓度分别达到0.125、0.250、0.500、1.250(g/L)，再用DMEM溶液调整使各孔总体积相等。培养48h后取出玻片，乙醇固定，再浸入去离子水中水化后，染色液避光染色1h，95%～100％系列乙醇脱水，以计算机图像处理染色结果。

　　1.5　细胞内胶原的测定　用³H-脯氨酸掺入法，分别制备正常FB及瘢痕FB细胞悬液至2×10⁸个/L，两种细胞均按表2分组加样，其中C为对照组，T₁～T₄为含不同浓度HASF的实验组，每组6孔，24h后各孔弃上清液100μl，再加入等体积反应液(为含1.48×10¹¹Bq/L　³H-脯氨酸、1mg/L β-氨基丙腈，50mg/L维生素C、10%小牛血清的DMEM)，孵育24h后消化细胞，细胞收集器收集细胞于玻璃纤维纸上，加闪烁液2ml/管，液闪计数仪测定³H-脯氨酸掺入率(1×10⁴细胞/min)。

表2　细胞培养加样表(μl)

　　Tab 2 Grouping and ingredent-volumes for cell cultrue (μl)

　　1.6　细胞上清液胶原的测定　用羟脯氨酸比色法，按前法制备正常FB及瘢痕FB悬液，按表2分组加样，每组6孔，孵育48h，各孔取上清液50μl，参照文献［4］，上清液在烤箱内烘干，加入4mol/L的NaOH 50μl，沸水浴中裂解胶原蛋白30min，依次加氯胺T及高氯酸溶液各1ml，65℃水浴中显色10min，550nm处测吸光度值；再配制不同浓度的羟脯氨酸标准液，同法测得550nm处吸光度值，绘制标准曲线，查阅曲线即得出细胞上清液中HYP含量。

　　2　结果

　　2.1　HASF的活性　HASF组上清液HA含量为813.4±126.7mg/L，明显高于血清对照组的308.5±62.1mg/L及空白对照组的152±30.2mg/L，差异有非常显著意义(P＜0.01)，表明提取的HASF对FB有明显的HA刺激活性。

　　2.2　HASF对细胞AgNORs的影响　光镜下可见细胞核内大小不等的黑色颗粒，此为嗜银蛋白结合Ag离子所形成的沉淀，借助计算机图像处理系统测定细胞核内平均银染灰度值以便对Ag颗粒定量分析(表3)。

表3　AgNORs的吸光度()

　　Tab 3 Absorbance of AgNORs()

与C组比较： ^*P＜0.05，^**P＜0.01

　　结果表明：随HASF浓度的提高，正常FB及瘢痕FB的AgNORs含量呈下降趋势。

　　2.3　HASF对细胞内胶原含量的影响　对于正常FB，HASF浓度较低的T₁、T₂组与对照组比计数率差异无显著意义(P＞0.05)；随HASF浓度增高，T₃、T₄组较对照组计数率分别下降了40.8%和85.9%(P＜0.01)。HASF对瘢痕FB也表现出了相似作用，瘢痕T₃、T₄组较对照分析下降21.5%和39.9%(P＜0.05，P＜0.01，图1)。

　　*P＜0.05 ，：P＜0.01

　　 图1　HASF对FB细胞内胶原含量的影响

　　Fig 1 Effect of HASF on intracellular collagen of FB

　　2.4　HASF对细胞上清液中胶原含量的影响　正常皮肤及瘢痕FB的T₂、T₃、T₄组HYP含量均较对照组显著下降(P＜0.05，P＜0.01)，可见随HASF浓度增高，两种细胞上清中HYP含量逐渐降低(图2)。比较图2与图1发现：细胞上清中HYP含量与³H-脯氨酸掺入率呈明显正相关(r正常=0.976,r瘢痕=0.983，P＜0.01)。

　　*P＜0.05， ：P＜0.01

　　 图2　HYP含量

　　Fig 2 Concentration of HYP

　　3　讨论

　　HASF是参与胚胎伤口愈合的重要因子，它能刺激体外培养的FB产生高浓度HA^［5］，而HA既影响细胞本身的增殖和移动性，又调节细胞基质的合成功能。我们将在兔羊水及胎兔血清中提取的HASF用于体外培养的正常FB及瘢痕FB，观察了该因子对两种细胞活性和胶原蛋白合成的影响。

　　HASF是新近被发现的蛋白质，目前尚无氨基酸序列的报道，Decker将提取的因子过分子筛纯化，认为是分子量150 000左右的一组糖蛋白，可能不是单一成分，它能刺激体外培养的FB产生高浓度的HA，因此该因子主要依靠活性鉴定^［3］。我们采用Decker所述方法提取HASF，将其用于正常皮肤FB，结果表明提取物有高度的HA刺激活性，可以判定提取物即为HASF。

　　AgNORs反映了细胞增殖及蛋白合成能力，它是核仁组成区(NORs)的嗜银非组蛋白。NORs能维持DNA呈伸展状态并调节转录，它的数量反映了细胞诱导分化能力及AgNORs的转录活性^［6］。人细胞DNA上有20对AgNORs的位置，它的增减直接反映了细胞增殖能力及蛋白合成的多少。结果表明HASF对正常FB及瘢痕FB的AgNORs含量有明显抑制效应，可见HASF抑制两类细胞增殖及蛋白的合成。

　　脯氨酸及羟脯氨酸均为胶原蛋白中特有的氨基酸，含量相对恒定^［7］，测定该两种氨基酸即可代表胶原的含量，利用³H-脯氨酸掺入法及HYP含量测定法分别测定细胞内及上清中胶原含量。结果表明，HASF对正常FB及瘢痕FB的胶原合成均有抑制作用，并呈现剂量依赖性，HASF对FB的这种胶原合成抑制作用可能影响伤口愈合过程中胶原的沉积及瘢痕形成；HASF是通过何种途径发挥上述效应尚未见文献报道，因HASF能刺激FB产生较高浓度的HA，而Victoria发现，高浓度HA是胎兔伤口愈合后胶原含量较成年兔显著降低的重要原因，^［8］推测HASF可能通过中间产物HA作用于FB导致胶原合成的减少，HASF的作用途径是否如此尚需进一步研究。

　　由细胞内及上清中胶原含量的测定看出，二者胶原含量高度一致。目前最常用的测定细胞胶原蛋白合成的方法为³H-脯氨酸掺入法，而测定上清中胶原含量的HYP测定法与³-脯氨酸掺入法所得结果很接近。我们认为一般上清液HYP含量的测定即能反映细胞内胶原的合成，且较脯氨酸掺入法操作简便，无放射性污染，是一种较好的胶原合成细胞外监测法。

　　参考文献

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(收稿：1997-12-09 修回:1998-03-10)