E-选择素mRNA在哮喘豚鼠支气管组织中的原位表达

中华结核和呼吸感染 1998年第1期第21卷 论著摘要

作者：曹国强 杨肇亨 周向东

单位：630042 重庆，第三军医大学附属大坪医院呼吸内科

　　　 实验将豚鼠制作出哮喘模型后，用原位杂交技术观察E-选择素的表达变化，旨从细胞粘附分子的角度探讨哮喘气道嗜酸性粒细胞（EOS）浸润的发生机理。

　　24只豚鼠，雌雄不限，体重300～550 g，随机分为正常对照组（C），哮喘组（A）。

　　a组:参照Hustson方法^［１］复制哮喘模型。探针制备及标记：E-选择素互补ONA(cDNA)质粒

　　pcDNAI（抗氨苄青霉素，5.0 kb）由美国M.P.Bevilacqua博士惠赠。含目的基因片段的质粒经常规转化→扩增→抽提→纯化后，用Xho I、Xba i双酶切下cDNA片段。使用宝灵曼公司生产的地高辛体外转录标记试剂盒标记探针。原位杂交：豚鼠支气管肺组织冰冻切片原位杂交参照文献［２］进行，略有改进。原位杂交阴性对照实验：在杂交液中加入地高辛标记的同义探针，其它步骤相同。杂交结果由图像分析系统处理，1只动物取5张切片(40×10视野下)，每张切片随机取５个含有支气管粘膜的视野（待测组织须充满整个视野）测量阳性呈色面积占整个视野面积的百分比，取５个视野的均值作为结果。豚鼠支气管粘膜组织炎细胞浸润程度测定：石蜡切片经修整、石蜡包埋后，切5μm切片，按常规进行HE染色，Olympus光学显微镜下观察，每只动物取5张切片（40×10视野下），每张切片随机取５个含有支气管粘膜的视野（待测组织须充满整个视野）用Weibel规格A型显微体形测量板计数单位面积EOS的数量，参照文献［３］进行支气管粘膜炎细胞浸润程度的判断（细胞浸润程度(0～3):0=无;

　　1=1～10 cells/mm²;2=10～50 cells/mm²;3=50 cells/mm²以上）。数据经t检验处理，结果以±s表示。

　　结果 哮喘豚鼠支气管粘膜EOS的浸润程度（1.3±0.5 cells/mm²）较正常对照组（0.3±0.3 cell/mm²）显著增加（P〈0.05）。E-选择素信使RNA(mRNA)的表达主要位于血管内皮细胞的胞浆内，小血管和毛细血管的血管内皮细胞均有表达，正常对照组血管内皮细胞呈低表达，上皮细胞的表达则不明显（图1～4）。图像分析结果显示，哮喘豚鼠支气管组织

　　e-选择素mRNA的表达（2.40%±1.12%）较正常对照组（0.84%±0.60%）显著增加（P〈0.001）。

　　e-选择素mRNA的表达量与豚鼠支气管粘膜的EOS浸润程度成显著正相关（r=0.64,P〈0.05）。

　　讨论 原位杂交结果定量分析表明，哮喘豚鼠粘膜下血管内皮细胞过度表达E-选择素

　　mRNA，E-选择素mRNA的表达量与支气管粘膜EOS的浸润程度成显著的正相关。这与Gosset等^［３］的免疫组化的研究结果一致。Okawara等最近用免疫电镜研究发现，哮喘支气管粘膜下的小静脉血管内皮细胞内的细胞粘附分子-1（ICAM-1，E-选择素和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1）的免疫反应定位于核周间隙、粗面内质网以及小血管腔的内皮细胞表面^［４］，证实这些细胞粘附分子是在细胞内主动合成的。血管内皮细胞的上述变化可使EOS与之的粘附数量增加，粘附能力增强，并进而跨内皮浸润到粘膜下层，导致哮喘以EOS浸润为主的慢性气道炎症。

　　图1哮喘豚鼠支气管粘膜上皮有较多嗜酸性粒细胞浸润(HE，×400)图2正常豚鼠支气管粘膜上皮未见明显嗜酸性粒细胞浸润(HE，×400)图3正常豚鼠支气管粘膜下微血管内皮细胞胞浆示紫蓝色，E-选择素mRNA阳性信号(原位杂交×400)图4哮喘豚鼠支气管粘膜下微血管内皮细胞胞浆示紫蓝色，E-选择素mRNA阳性信号(原位杂交×400)

　　收稿：1997-04-24 修回：1997-09-26

　　　　　　　　　　　　　　　　参考文献

　　1　Hoston PA, Varleya JG, Sanjar S, et al. Evidence that neutrophils do not

　　particpate in the late-phase airway reponse provoked by ovalbumin inha

　　lation in conscious, sensitized guinea pigs. Am Rev Respir Dis,1990, 1

　　41:535-539.

　　2　蔡文琴， 王伯云.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.四川：四川科学技术出版社,

　　1994.406-434.

　　3　Gosset P, Tillie-Leblond I, Janin A, et al.Expression of e-selectin, I

　　cAM-1and VCAM-1 on bronchial biopsies from allergic and non-allergic as

　　thmatic patients.Int Arch Allergy Immunol, 1995,106:69-77.

　　4　Ohkawara Y, Yamauchi K, Maruyama N, et al. In situ expression of the cell

　　adhesion molecules in bronchial tissues from asthmatics with airflow limitation:in

　　vivo evidence of VCAM-1/VLA-4 interaction in selective eosinophil infiltration.Am J Respir Cell Mol Biol,1995,12:4-12.