哮喘豚鼠肺内P物质的分布与地塞米松对其影响

中华结核和呼吸感染 1998年第1期第21卷 论著

作者：吴昌归 孙滨 毛宝龄

单位：710032 西安 第四军医大学西京医院呼吸内科(吴昌归、孙滨)；第三军医大学新桥医院呼吸病研究所(毛宝龄)

　　关键词： 哮喘；P物质；免疫组织化学；计算机图像分析；地塞米松

　　【摘要】 目的 研究哮喘豚鼠肺内P物质(SP)的分布及地塞米松对其影响。方法实验动物分为3组即哮喘组、地塞米松组和对照组。采用兔抗SP血清、免疫组织化学ABC法和葡萄糖氧化酶-DAB-镍呈色及计算机图像分析技术进行测定。结果与对照组相比，哮喘豚鼠肺内支气管至终末细支气管有较密集的SP免疫反应(SP-IR)阳性串珠状纤维分布，成束走行，以平滑肌层和基底膜为主。此外，呼吸性细支气管和肺泡管也可见阳性纤维。地塞米松处理后，

　　sP-IR阳性纤维的分布和形态与对照组基本类似。结论气道变应性炎症引起SP-IR阳性纤维增生可能是哮喘发作时体液SP增多的主要原因之一，参与了哮喘气道炎症的维持和发展。

　　The distribution of substance P in the lungs of asthmatic guinea-pigs and

　　the influence of dexamethasone on the distribution Wu changgui, Sun Bin,

　　mao Baoling. Department of Respiratory Disease, Xijing Hospital, the 4th Military

　　medical University, Xi′an 710032

　　【Abstract】Objective To investigate the distribution of substance P(SP) in

　　the lungs of asthmatic guinea pigs and the effects of dexamethasone on its distribution.

　　Methods Guinea pigs were divided into 3 groups: asthma group, dexamethasone-treated

　　group and control group. Rabbit serum against SP, immunohistochemical ABC method

　　and glucose-DAB-nickel technique for staining and computer image analysis were used

　　in this study.Results There was distribution of SP-IR positive fibres in airways in asthma

　　group than the other two groups. The positive fibres, emerged like a string of beads, were

　　present as large fibre bundles in the smooth muscle layer and basement membrane. Additionally,

　　in the asthma group SP-IR positive fibres were detected on the walls of respiratory bronchioles

　　and alveolar ducts in contrast to the other groups. There was no differance in distribution and

　　morphorlogical characteristic between the control group and the dexamethasone-treated group.

　　Conclusion Repeated antigen challenges, which cause the allergic inflammation of airways,

　　may result in the growth of SP-containg nerve fibres in the airway and synthesis of SP in

　　neurons. These may be involved in the persistence and exacerbation of airway inflammation

　　in asthma. Dexamathasone can reverse the distribution of SP-IR positive fibres to the normal

　　status in airway walls of asthma guinea pigs.

　　【Key words】 asthma Substance P immunohistochemistry Computer image analysisDexamethasone

　　近年来非肾上腺素能非胆碱能神经(NANC)与哮喘的关系受到了国内外学者的关注。有研究表明哮喘患者痰液和血清内P物质(SP)含量明显高于健康对照者，且与病情严重程度相关^{［１，２］}，提示SP参与了哮喘的发生和发展过程。然而对哮喘患者体液SP增多的确切原因以及糖皮质激素对其影响，目前尚未阐明。SP由肺内感觉神经末梢释放，主要被中性内肽酶(NEP)和血管紧张素转化酶(ACE)所降解。含SP纤维在肺内分布多寡可能对体液SP含量的高低产生影响。我们以免疫组织化学ABC法、葡萄糖氧化酶-DAB-镍染色技术^［３］及计算机图像分析，比较了哮喘组、地塞米松组和对照组豚鼠肺内SP免疫反应(SP-IR)阳性纤维分布和形态差异，为哮喘的防治提供实验依据。

　　　　　　　　　　　　　　　材料与方法

　　1.实验动物及分组：选择体重250～350 g雄性健康豚鼠(本校实验动物中心提供)，颗粒饲料喂养，自由饮水，习服3天后随机分成3组即哮喘组、地塞米松组和对照组。哮喘组豚鼠于实验的第1天腹腔内注射5%卵白蛋白和5%氢氧化铝混合液1.0 ml；第10天开始吸入1%卵白蛋白气溶胶至呼吸困难、发绀和痉挛性咳嗽，每天1次，连续10天。地塞米松组豚鼠接受与哮喘组豚鼠相同的卵白蛋白致敏和吸入攻击程序，所不同的是在10天吸入攻击结束后，每日腹腔内注射地塞米松5 mg/kg，连续3日。对照组用生理盐水代替卵白蛋白溶液和地塞米松。

　　每组6只豚鼠。

　　2.组织标本制作：于实验的第23日以0.4%戊巴比妥钠静脉(40 mg/kg)麻醉豚鼠，开胸经肺动脉插管快速灌注生理盐水500 ml，继以4℃，4%多聚甲醛持续灌注60分钟，取出肺脏，剪下右下肺，充分吸尽肺内气体后，置4℃ 4%多聚甲醛中后固定4小时，然后于20%蔗糖溶液中4℃过夜。CO₂冰冻切片机切片，片厚50 μm。

　　3.免疫组织化学染色：切片以PBS漂洗，经甲醇双氧水、牛血清白蛋白和Triton x-100处理后，加入兔抗SP血清(1∶5 000，Watpa)，4℃下孵育72小时；加生物素化的羊抗兔

　　igG血清(1∶5 000，Sigma)，室温下反应4小时；加卵白素(Avidin)结合的辣根过氧化物酶复合物(1∶500，Sigma)，室温下作用2小时；最后以葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵反应液呈色15～20分钟。每一步骤前均以0.01 mol/L PBS(pH7.4)振荡漂洗。呈色反应终止后，常规裱片、干燥、脱水、透明和封片。

　　对照试验用同等稀释度的正常家兔血清和血清稀释液代替第一抗体，其它实验步骤不变。

　　4.计算机图像分析：以肺内支气管为分析对象，采用德国Leitz公司TAS plus图像分析仪，测量单位面积内SP-IR阳性纤维条数。

　　5.统计学处理：以两均数比较，t检验在三组间进行两两比较。

　　　　　　　　　　　　　　　　　结　　果

　　一、对照豚鼠肺内SP-IR阳性分布

　　对照豚鼠肺内支气管至终末细支气管和肺血管壁均可见SP-IR阳性纤维分布，而呼吸性细支气管和肺泡道则未见阳性纤维。其分布特点是：(1)纤维稀疏，呈串珠样单条走行；(2)

　　随气道口径的变小、管壁纤维密度逐渐增大；(3)主要分布于平滑肌层，次为基底膜，粘膜下腺体周围和上皮内亦可见之(图1～3)。

　　二、哮喘豚鼠肺内SP-IR阳性分布

　　与对照组相比，哮喘豚鼠肺内支气管至终末细支气管可见较多的SP-IR阳性纤维。此外，在呼吸性细支气管肺泡道亦有分布(图4～6)。其分布特点是：密集，呈束状走行；在平滑肌层增多更为明显。

　　三、地塞米松对哮喘豚鼠肺内SP-IR阳性分布的影响

　　哮喘豚鼠地塞米松处理后，肺内SP-IR阳性纤维分布和形态均与对照组基本类似(图7，8)。

　　四、肺内支气管SP-IR阳性纤维分布的计算机图像分析

　　在哮喘豚鼠每平方毫米内SP-IR阳性纤维数为2.5±0.7条，明显多于对照组(每平方毫米含SP-IR阳性纤维1.5±0.6条)和地塞米松组(每平方毫米含SP-IR阳性纤维1.3±0.4条)。P均〈0.01。

　　而后两组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。

　　　 　　　　　　　　　　　　　讨　　论

　　SP是NANC神经系统的主要兴奋性递质之一，广泛分布于肺内，对肺功能发挥重要的调节作用。业已证实SP除能收缩气道平滑肌外，尚能增加微血管壁通透性，促进粘膜水肿的形成，激活中性粒细胞，嗜酸性细胞和肺泡巨噬细胞，上调血管内皮细胞表达粘附分子，有利于炎性细胞渗出，在神经性气道炎症中起一定作用^［４］。由此将SP和哮喘联系起来。我们研究发现哮喘豚鼠气道SP-IR阳性纤维明显多于对照组和地塞米松组豚鼠，提示SP阳性纤维的增多可能参与哮喘的病理生理过程，与哮喘症状的发生有一定关系；同时也表明增生的该类纤维在适当刺激因子作用下释放SP，可能成为体液SP含量升高的主要原因之一。SP一经释放便在NEP和ACE作用下快速降解。NEP主要分布于粘膜上皮内，而ACE则主要存在于肺血管内皮细胞^［５］。因此SP在肺内的扩散或转运距离对其含量和作用强度产生明显影响。我们的研究发现哮喘豚鼠气道SP-IR阳性纤维的增多主要表现在肺内支气管至终末细支气管的平滑肌层中，且呼吸性细支气管和肺泡道壁亦见阳性纤维，这一结构特点为SP对平滑肌和肺泡巨噬细胞等肺内炎性细胞行使功能提供了便利的形态学基础。

　　哮喘状态下SP-IR阳性纤维增多的确切原因尚不完全清楚，可能与哮喘气道的慢性炎症有关。有研究指出炎症部位所释放的神经生长因子，刺激SP能神经纤维的增生，并增强神经元内速激肽前体的转录^［６］；白细胞介素-１β(IL-1β)上调神经节内SP的表达^［７］。我们在实验中发现，使用地塞米松抑制气道炎症，减少炎性介质和细胞因子的释放，能使SP-I

　　r阳性纤维的分布和形态恢复正常。

　　综上所述，哮喘豚鼠气道炎症可能刺激SP能神经纤维增生、释放多量SP，而过多SP又作用于肺组织，使炎症反应加剧，两者互为因果，使哮喘得以延续和发展。

　　图1对照豚鼠支气管平滑肌层和基底膜上可见单条走行的串珠状SP-IR阳性纤维(ABC，×4

　　00)图2对照豚鼠细支气管平滑肌层和基底膜上可见单条走行的串珠状SP-IR阳性纤维(A

　　bC，×400)图3 对照豚鼠呼吸性细支气管和肺泡管未见SP-IR阳性纤维分布(ABC，×100)

　　图4哮喘豚鼠支气管平滑肌中可见成束的串珠状SP-IR阳性纤维，但基底膜和上皮内

　　sP-IR阳性纤维仍呈单条走行(ABC，×400)图5哮喘豚鼠细支气管平滑肌层内可见成束

　　sP-IR阳性纤维(ABC，×400)图6哮喘豚鼠呼吸性细支气管和肺泡管可见单条走行的

　　sP-IR阳性纤维(ABC，×100)图7哮喘豚鼠经地塞米松处理后支气管SP-IR纤维分布情况(×

　　400)图8哮喘豚鼠经地塞米松处理后细支气管SI-IR纤维分布情况(ABC，×400)

　　　　　　　　　　　　　　　　　参考文献

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　　proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:3200-3202.

　　收稿：1997-01-26 修回：1997-07-21