热休克蛋白70、90基因在糖皮质激素抵抗型哮喘患者血单个核细胞中的表达

中华结核和呼吸感染 1998年第5期第0卷 论著

作者：姚彬　佟万成　朱元珏　罗慰慈　李明文　田文　李如臻

单位：264000 烟台，山东省烟台毓璜顶医院(姚彬、李明文、田文、李如臻)；中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院(佟万成、朱元珏、罗慰慈)

　　关键词： 热休克蛋白；哮喘；反转录-聚合酶链反应；外周血单个核细胞

　　【摘要】　目的　探讨热休克蛋白(HSP)70、90α、90β信使核糖核酸(mRNA)在糖皮质激素抵抗型(SR)哮喘发病机制中的作用。方法　分激素抵抗型(SR)哮喘组9例，激素敏感型(SS)哮喘组16例，正常对照组10例，采用反转录－聚合酶链反应(RT-PCR)法测定研究对象外周血单个核细胞(PBMC)中的HSP70、90α、90β mRNA的表达；利用淋巴细胞增殖抑制试验观察地塞米松(Dex)对研究对象淋巴细胞增殖的抑制程度。结果　正常人的PBMC中不表达HSP70 mRNA。SR哮喘患者中HSP70、90α、90β mRNA的表达依次为2.95±1.12、2.17±0.89、2.22±0.83明显高于SS哮喘患者HSP 70、90α、90β mRNA的表达，依次为0.23±0.09、1.07±0.39、0.94±0.32(P＜0.01)。两者的HSP90α、90β mRNA表达均显著高于正常人依次为0.45±0.19、0.32±0.15(P＜0.01)。SS、SR哮喘患者的HSP70、90α、90β mRNA表达与Dex为10^-7mol/L时的淋巴细胞增殖抑制程度之间的直线相关分析呈显著正相关(P＜0.01)。结论　SR哮喘患者的PBMC中均有HSP70、90基因的表达,且随着炎症程度的加重和持续时间的延长，这种表达能力增强。HSP90基因表达水平越高,Dex越难以抑制淋巴细胞的增殖。

Study on HSP70、90 mRNA gene expression in peripheral blood mononuclear cells with steroid-resistant asthmatics

Yaobin,Tong Wancheng, Zhu Yuanjue, et al. Respiratory Department ,Yuhuangding Hospital of Yantai , Yantai 264000

　　【Abstract】　Objective　To investigate the role of heat shock protein(HSP)70、90α、90β mRNA on the pathogenesis of steroid-resistant(SR) asthma.Method　9 SR asthmadics 16 steroid sensitive (SS) asthmatics and 10 normal healthy volunteers were studied. With reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR),the expression of hsp70、90α、90β mRNA were detected in peripheral blood mononuclear cell(PMBC) from normal volunteers and SR. steroid-sensitive(SS) asthmatics. Inhibition of PHA-induced lymphocyte proliferation by dexamethasones (Dex) was investigated using lymphocyte proliferation assay.Result　There were no expression of hsp70mRNA in PMBC of normal volunteers; the levels of expression of hsp70,90α,90β mRNA in PBMC of SR asthmatics (70=2.95±1.12, 90α=2.17±0.89, 90β=2.22±0.83) were significantly higher than SS asthmatics (70=0.23±0.09, 90α=1.07±0.39, 90β=0.94±0.32) (P＜0.01) and normal volunteers (70=0, 90α=0.45±0.19, 90β=0.32±0.15) (P＜0.01); There were significantly positive correlation between the degree of inhibition by Dex(10^-7mol/L) of SR、SS asthmatics of proliferation of T lymphocytes and the expression of hsp70、90α、90β mRNA in PMBC(P＜0.01).　Conclusion　There were expression of hsp70、90α、90β gene in PMBC from SR asthmatics ,but increased with worsening of inflammation and prolonging of the duration of disease. The more hsp 90 gene expression ,the less T lymphocytes were inhibited by dex.

　　【Key words】　HSP　　Asthma　　RT-PCR　　PMBC

　　热休克蛋白(HSPs)是一组在正常状态下含量极低或无,结构高度保守的蛋白^［1］。其中HSP90具有与糖皮质激素受体结合,发挥其最大功效的作用^［2］。自从发现支气管哮喘患者,尤其是糖皮质激素抵抗型(SR)哮喘患者存在T淋巴细胞的糖皮质激素受体异常以来^［3］,尚没有对HSP90信使核糖核酸（mRNA）在SR哮喘患者中的表达及与糖皮质激素受体之间的关系进行过研究。为此,我们利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定了研究对象外周血单个核细胞(PBMC)中HSP70、90α、90β mRNA的表达水平。

　　对象与方法

　　1.对象：全部哮喘患者来自山东医科大学附属医院门诊和住院部。诊断根据中华医学会呼吸系病学会制定的标准,排除吸烟和其它肺部疾病。停用激素2周。所选患者的基础一秒钟用力呼气容积FEV₁均低于70%预计值，且支气管可逆试验阳性。SR和激素敏感型（SS）哮喘的分类根据Carmichael等^［4］方法。SR哮喘患者9例，其中男3例，女6例，年龄22～70岁，病程0.5～40年；SS哮喘患者16例，其中男12例，女4例，年龄25～67岁，病程0.5～40年。两组的年龄和病程经卡方检验，差异无显著性（P＞0.05）。

　　2.正常对照：来自健康献血员，共10名，男7例，女3例。年龄22～41岁。

　　3.材料：³H标记的胸腺嘧啶核苷（³H-TdR）购自中国原子能研究所，植物血凝素（PHA）和氟美松（Dex）购自美国Sigma公司，鼠白血病病毒（MML-V）逆转录酶系GIBCO-BRL公司产品，RNA酶抑制剂（RNasin）及Taq 脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶系华美公司产品，检测人类HSP70、90α 、90β mRNA系统（包括基因重组技术合成的复合内参照核糖核酸（RNA）片段、反转录引物-Oligo寡脱氧胸苷酸（dT）18及三对寡核苷酸引物）由中国协和医科大学基础医学研究室沈羽非、吴宁华教授惠赠。PCR仪系ERICOMP公司产，高速薄层扫描仪（GelScan-XL）系Shimadzu公司产品。

　　4.方法：(1)PBMC的制备：晨起8时抽患者空腹外周静脉血20 ml，肝素防凝，分5、15 ml常规分离PBMC，5 ml分离出的PBMC调成1×10⁶浓度的细胞悬液，立即用于淋巴细胞增殖抑制试验，15 ml分离可获取6×10⁷的PBMC，然后立即置液氮中冻存，用于HSP的基因检测。(2)淋巴细胞增殖抑制试验（³H-TdR掺入法）：参照Corrigan等^［5］法稍加修改。按实验设计分4组：A组：只加细胞悬液；B组：细胞悬液+PHA；C组：细胞悬液+PHA+Dex；D组：细胞悬液+Dex10^-6mol/L，细胞收集后应用液体闪烁计数器（LS3801，Beckman USA）计数每分钟闪烁记数。结果计算C组各孔细胞增殖百分率。

　　(3)总RNA的提取：异硫氰酸胍一步法提取RNA^［6］，测RNA的光密度（A，曾称OD），A260/A280=2.0后存于-70℃中。(4)RT-PCR：反转录合成cDNA第一链：将0.5 ml Eppendorf管置冰中，然后混合下列反应成分：5×反转录缓冲液4 μl ,4×脱氧核苷三磷酸（dNTP）（各10 mmol/L）1 μl ,RNasin 20 μg, 二硫苏糖醇（DTT）(100 mmol/L)，Oligo(dT)₁₈(50 mmol/L) 2 μl ,内参照核糖核酸（cRNA）2 μl, 总RNA 2 μg， 焦碳酸二乙酯（DEPC）水加至19 μl , 65℃保温5分钟。然后加MML-V反转录酶（200 U/μl）1 μl ,37℃保温1小时，94℃加热5分钟使酶灭活。PCR：PCR体系在冰上进行：10×PCR缓冲液2 μl ,5′－引物（10 mmol/L）和3′－引物（10 mmol/L ）各2 μl，内参照脱氧核糖核酸（cDNA）2 μl, 4×dNTP（各2.5 mmol/L）2 μl,DEPC水9 μl，然后94℃加热5分钟。再加Taq DNA聚合酶（1 U/μl）1 μl，30 μl石蜡油封闭。PCR条件：94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2.5分钟，循环次数为19次。PCR扩增完毕，取12 μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果拍成黑白照片以备扫描。(5)扫描分析：在GelScan -XL扫描仪上扫描黑白照片，记录各DNA扩增带的密度。每一种HSP的DNA扩增片段密度与其相应的内参照DNA扩增片段密度的比值（e/c）,即为该种HSP mRNA水平的定量指标。

　　5.统计学处理：数值以百分率及均数±标准差表示。计量资料用非配对t检验及直线相关系数分析，计数资料用χ²检验。

　　结果

　　一、淋巴细胞增殖抑制试验

　　观察了不同浓度的Dex对淋巴细胞增殖的抑制作用(表1)，显示在Dex浓度为10^－7mol/L时，对SR组对T淋巴细胞增殖的抑制作用明显弱于SS组(P＜0.05)。

　　二、HSP70、90α、90β mRNA的表达（e/c）

　　SR组的HSP70mRNA的表达明显高于SS组。SR、SS、正常对照组中的HSP、90α、90β mRNA的表达依次递减，差异均有显著性（P＜0.01，表2)。

　　三、直线相关分析

　　SR、SS组在Dex浓度为10^-7mol/L时的T细胞增殖百分率与HSP70、90基因表达之间的关系。经直线相关系数分析呈高度正相关，SR哮喘中HSP70，r=0.93，HSP90α，r=1.30，HSP90，r=0.96，P均＜0.01；SS哮喘中HSP70，r=0.96，HSP90α，r=0.94，HSP90β，r=0.73，P均＜0.01。

表1　三组患者的T淋巴细胞增殖的抑制作用(±s)

表2　三组患者外周单个核细胞中三种热休克蛋白的mRNA表达水平(e/c)

　　讨论

　　Carmichael等^［4］在详细描述了SR哮喘的临床特征后，将口服强的松（20 mg/d）1周后FEV₁改善低于15%定为诊断SR哮喘的标准，FEV₁改善超过30%为SS哮喘^［4］。我们根据这一标准选择了9例SR、16例SS哮喘患者。在对其进行的加入Dex的淋巴细胞增殖试验中发现，当Dex浓度为10^-8mol/L时，对淋巴细胞增殖的抑制程度在SR和SS两组之间就已经出现差异，当浓度达到10^-7mol/L时（相当于口服强的松5～10 mg），其抑制程度SR组明显弱于SS组（P＜0.01），与Corrigan等^［5］的报道相一致。从剂量－反应曲线看，T细胞对糖皮质激素的抵抗，反映了这一曲线的偏移，并不存在一个绝对的抵抗^［7］。由于常规剂量的糖皮质激素，不足以在体内对细胞功能产生明显抑制，致使临床上出现糖皮质激素抵抗现象。

　　HSPs是一个庞大的家族，根据其功能和分子量的不同分为三族：HSP90族，HSP70族，HSP低分子族。其中HSP90族，HSP70族尤为引人注意。HSP90具有与激素受体结合，调节其空间构型，增加与配体的亲和力，跨膜运转已结合的受体进核等功能^［2］。本组研究表明，SR组的HSP90α、90β mRNA的表达明显高于SS组和正常对照组，三组间经统计学处理差异有显著性（P＜0.01）。说明(1)SR哮喘患者存有HSP90的基因表达。(2)随着炎症程度的加重和持续时间的延长，这种表达明显增强。但这种过量的表达并没有增加糖皮质激素受体的亲和力，反而出现下调作用，HSP90mRNA的表达水平与淋巴细胞增殖抑制试验之间的直线相关性分析呈正相关，说明了这一问题。即HSP90mRNA的表达水平越高，糖皮质激素越难以抑制淋巴细胞的增殖。推测认为，过量的HSP90，可使HSP90与糖皮质激素受体结合的反应曲线右移，造成糖皮质激素受体复合物的稳定性减低^［8］，从而使有效的糖皮质激素受体数目减少。提示HSP90在SR哮喘的发病机制中起着重要的作用。

　　HSP70是细胞内典型的分子伴侣，具有多种生理功能，在各种应激过程中对细胞起保护作用^［9］。Vignola等^［10］的研究发现，哮喘患者的气道上皮细胞和肺巨噬细胞中HSP70的表达明显高于慢性支气管炎和正常人，并且与哮喘的严重性和支气管肺泡灌洗液中嗜酸性细胞的百分比明显相关。本组研究中，正常人的PBMC中不表达HSP70 mRNA，SR哮喘患者HSP70 mRNA的表达明显高于SS组（P＜0.01），且与淋巴细胞增殖抑制试验做的直线相关分析呈显著正相关表明，由于SR哮喘存有淋巴细胞的持续活化，细胞因子的不断分泌，使HSP70 mRNA的表达明显增强。提示本项指标可用以分析哮喘的严重程度，指导治疗、判断预后。

　　志谢　中国医学科学院、中国协和医科大学基础医学研究所生化教研室沈羽非、吴宁华、林小勤同志给予本实验亲切指导和无偿援助，特致谢

　　本课题受山东省卫生厅青年科研基金资助(基金编号：96-25)

　　参考文献

　　1　Dwyer BE, Nishimura RN . Heat shock Proteins in hypoxic-ischemic brain injury .Brain path,1992,2:245-250.

　　2　Picard D,Khursheed B. Gaabediann M,et al . Reduced level of hsp90 Comtromise steroid receptor action in vivo. Nature, 1990,348:166-169.

　　3　Sher ER, Leung DYM, Surs W, et al . Steroid－resistant asthma cellular mechanisms contributing to inadequate response to glucocorticoid therapy. J Clin Invest, 1994,93:33-35.

　　4　Carmichael J, Paterson IC, Diaz P, et al . Corticosteroid resistance in Chronic asthma . Br Med J 1981,282:1419-1422.

　　5　Corrigan CJ, Brown PH, Barnes NC, et al .Glucocorticoid Pharmacokinetics, glucocorticoid receptor characteristics, and inhibition of peripheral blood T cell proliferation by glucocorticoids in vitro. Am Rev Respir Dis , 1991,144:1016-1018.

　　6　Chomczynki H, Sacchi N. Singal-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocynanatephenol-chloroform extration. Analytical Biochemistry .1987,162:156-160.

　　7　Bohen sp . Hsp90 mutants disrupt glucocorticoid receptor ligand blinding and destabilize aporeceptor complexes, J Biol chem, 1995,270:29433-29436.

　　8　Jaattela MJ, Wissing D. Emerging role of heat shock proteins in biology and medicine. Ann Med, 1992,24:249-255.

　　9　Vignola MA, Chanez P, Polla BS . Increased expression of heat shock protein 70 on airway cells in asthma and chronic bronchitis . Am J Cell Mol Biol , 1995,13:683-689.

　　10　孙永昌 罗慰慈 朱元珏.糖皮质激素抵抗型哮喘的免疫学研究。中华结核和呼吸杂志，1997，20：12-15.

(收稿：1997-07-02　　修回：1997-12-15)