哮喘患者及豚鼠模型血浆肺组织内皮素1测定及亚硝基左旋精胺酸甲酯的影响

中华结核和呼吸感染 1998年第5期第0卷 论著

作者：杜捷夫　崔德健　郭英江　吕国平　陆连荣　王亚平

单位：100037 北京，解放军第三○四医院呼吸科(杜捷夫现在解放军总医院急诊科)

　　关键词： 哮喘；内皮素；一氧化氮；肿瘤坏死因子

　　【摘要】　目的　研究哮喘发作患者血浆和豚鼠哮喘模型血浆、肺组织内皮素1（ET-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的变化及一氧化氮（NO）合成酶抑制剂亚硝基左旋精胺酸甲酯（L-NAME）对其影响。方法　选择患者及建立豚鼠哮喘模型，应用放射免疫法测定ET-1，酶联法测定TNF-α，硫代巴比妥酸法及羟胺氧化法测MDA和SOD。结果　哮喘患者血浆ET-1、TNF-α及MDA分别为33±15(×10^-9g/L)，3.18±0.65(×10^-9g/L)，8.2±1.5 (×10^-6mol/L) 显著高于对照组14±4(×10^-9g/L)，2.34±0.08 (×10^-9g/L)，4.9±1.3(×10^-6mol/L，P＜0.01)；而哮喘患者血浆SOD活力为135±26(×10^-3NU/L) ，显著低于对照组161±19(×10^-3NU/L，P＜0.01)。豚鼠模型血浆、肺组织ET-1含量为127±8(×10^-9g/L)，243±58(×10^-8g/g)；TNF-α含量为3.50±0.13(×10^-9g/L)，32.4±3.5(×10^-8g/g)；MDA含量为21.3±4.3(×10^-6mol/L)，178.0±31.8(((×10^-5mol/g )；显著高于对照组血浆肺组织ET-1含量90±10(×10^-9g/L)，138±34(×10^-8g/g) ；TNF-α含量2.19±0.09(×10^-9g/L) ，20.3±1.7(×10^-8g/g)；MDA含量10.5±3.2(×10^-6mol/L)，125.3±16.7(×10^-5mol/g，P＜0.01)。而豚鼠哮喘模型血浆、肺组织SOD活力为111±17(×10³NU/L)，1083±226（NU/g)；显著低于对照组SOD活力147±21(×10³NU/L)，1380±105(×NU/g，P＜0.01)。雾化吸入氟美松或腹腔注射L-NAME后哮喘组豚鼠各项指标恢复至接近对照组水平。结论　ET-1、TNF-α、氧自由基及其与NO的反应产物在哮喘的发病机制中可能起重要作用，L-NAME除可减少NO生成外，也能减少豚鼠哮喘模型ET-1、TNF-α和氧自由基的生成，这方面的作用与皮质激素相似。

Detection of ET-1, tNF-α, oxidative radicals in sera of asthmatics and in sera and lung tissue of asthmatic guinea pigs

Du Jiefu, Cui Dejian, Guo Yingjiang, et al. Division of Respiratory Medicine, 304 Hospital, Beijing 100037

　　【Abstract】　Objective　To investigate the role of the ET-1、TNF-α and oxidative radicals of MDA and SOD in the pathogenesis of asthma and the effect of the nitric oxide synthase inhibitor, L-NAME to above factors.Method　ET-1 was detected by the radio-imunoassay and TNF-α was detected by ELISA, SOD and MDA were detected by using thiobarbituric acid method.Result　The contents of ET-1, TNF( andMDA in the serum of the asthmatic patients and in the serum and lung tissue of asthma models of guinea pigs were significantly increased, in the contrast ,the content of SOD was decreased compared with those in the controls(P＜0.01). All the ehanges in the serum and in the lung tissues of the asthma models of guinea pigs returned to the levels of the controls by dexamethasone inhalation or L-NAME by intraperitoneal injection.Conclusion　ET-1, TNFα and the oxidative radicals and NO may play important roles in the pathogenesis of asthma, L-NAME, which is similar to the dexathamethsone, may either decrease the content of NO or decrease the content of ET-1, TNFα and oxidative radicals in asthma.

　　【Key words】　Asthma　　Endothelium　　Nitric oxide　　Tumor necrosis factor

　　内皮素（ET）1是体内最强的内源性血管活性肽，对肺通气功能和肺循环具有重要调节作用，参与许多呼吸系疾病的发病过程。肿瘤坏死因子（TNF-α）一方面参与机体的免疫防御机制，另一方面是介导休克和炎症反应的重要因子。炎细胞聚集和激活后所产生的大量氧自由基可加重炎症反应并造成组织损伤。这些因子相互影响，可能以多重效应介导哮喘的发病。我们研究的目的是通过观察哮喘患者及豚鼠哮喘模型发作时，血浆和肺组织ET-1、TNF-α、氧自由基引发脂质过氧化的中间产物丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的变化，以及皮质激素和一氧化氮合酶（NOS）抑制剂左旋亚硝基精胺酸甲酯（L-NAME）对以上因子的影响，探讨它们在哮喘发病机制中的作用和相互关系。

　　对象与方法

　　1.研究对象及标本的制备：19例发作期支气管哮喘来自住院的患者，诊断按1993年全国哮喘会议制定的标准。男12例，女7例，年龄36±10岁，19名健康对照者来自本院无心肺疾病史及体检无异常发现的志愿者，男15名，女4名，年龄40±12岁，两组性别年龄差异无显著性。哮喘组取血前48小时未应用皮质激素类药物，两组均于清晨取静脉血6 ml，4 ml置于含10%EDTA抑肽酶试管，2 ml置含肝素试管中混匀，4℃离心，取血浆待测。

　　雄性DHP豚鼠，鼠龄12周，体重300±20 g（解放军304医院动物室提供），随机分为四组(1)对照组(19只)：腹腔注射生理盐水(0.5 ml/100 g BW)，14天后于每日上午8～9时予生理盐水超声雾化吸入15分钟，共吸7天；(2)哮喘组(19只)：腹腔注射10%卵蛋白生理盐水(0.5 ml/100 g BW)，14天后每日给予1%卵蛋白生理盐水超声雾化吸入诱发哮喘，共吸7天；(3)糖皮质激素组(9只)：按哮喘组法制作动物模型，每日激发前予超声雾化吸入20%氟美松15分钟；共吸7天；(4)L-NAME组(11只)：按哮喘组方法制作豚鼠哮喘模型，14天后，每日给予1%卵蛋白生理盐水超声雾化吸入诱发哮喘，每日激发前腹腔注射L-NAME 1 mg/kg BW，共吸7天。于第22天上午各组动物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取腹主动脉血，制备血浆方法同上。称取100 mg肺组织2份，剪碎，各置于含1 ml 1mol/L乙酸和1 ml 0.01 nol/L PBS的玻璃匀浆器中，水浴煮沸后在冰浴下用电子恒速组织匀浆器研磨匀浆，离心后取上清液待测。

　　2.实验方法：血浆及肺组织ET-1检测采用非平衡放射免疫法，试剂盒由东亚放射免疫所提供；TNFα测定采用双抗体夹心酶联法（ELISA),试剂盒由北京邦定公司提供；MDA及SOD分别采用硫代巴比妥酸法及羟胺氧化法测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。氟美松及L-NAME分别为北京第二制药厂和Sigma公司产品。

　　3.实验数据的统计学处理：采用SDAS统计软件（万道公司）行F检验及q检验，P＜0.01为差异极其显著，P＜0.05为差异显著。

　　结果

　　一、哮喘发作期患者各项指标的含量

　　哮喘组患者血浆ET-1、TNF-α、MDA均显著高于对照组(P＜0.01)，SOD则显著低于对照组(P＜0.05，表1)。

表1　哮喘发作期患者血浆各项指标含量(±s)

　　注：与对照组比^*P＜0.01，^**P＜0.05　　表1示哮喘组患者血浆ET-1、TNF-α、MDA均显著高于对照组；SOD 则显著低于对照组（1NU为一个活力单位）。

　　二、豚鼠哮喘模型血浆肺组织ET-1及TNF-α含量

　　哮喘组豚鼠血浆、肺组织ET-1、TNF-α显著高于对照组；皮质激素及L-NAME处理组则显著低于哮喘组(表2)。

表2　各组豚鼠血浆和肺组织ET-1及TNF-α含量(±s)

　　表3　各组豚鼠血浆肺组织MDA含量及SOD活力(±s)

　　注：与对照组比^*P＜0.01；^**P＜0.05；与哮喘组比^△P＜0.01；^△△P＜0.05　　三、豚鼠哮喘模型血浆肺组织MDA及SOD含量

　　哮喘组豚鼠血浆、肺组织MDA显著高于对照组，SOD则显著低于对照组；皮质激素及L-NAME 处理组MDA均显著低于哮喘组，SOD除L-NAME 组血浆含量外，其余各组均显著高于哮喘组(表3)。

　　讨论

　　内皮素-1是已知最强的缩血管和支气管物质，除来源于血管内皮细胞外，呼吸系统有广泛的ET和ET受体分布，尤以哮喘发病的靶器官气道上皮含量最丰富。本组研究显示，哮喘发作期患者血浆和豚鼠模型血浆及肺组织ET-1显著高于对照组。据报道^［1］，支气管平滑肌细胞和上皮细胞、肺泡巨噬细胞和中性粒细胞在受TNF-α、白细胞介素1等细胞因子的刺激以及缺氧条件下，ET分泌明显增高，后者可激活　15-脂氧化酶和花生四烯酸代谢，导致支气管收缩、炎细胞趋肺和气道炎症反应加重。炎症反应所致炎细胞及细胞因子增多又使ET 合成释放增加，形成内皮素-炎性细胞因子之间的恶性循环。ET尚可促进肺血管和支气管平滑肌及成纤维细胞的增殖。ET的这些特性，结合本组实验结果，表明它可能在哮喘的发病和慢性患者的气道重组中起重要的作用。

　　本组研究显示哮喘发作期患者血浆和豚鼠模型血浆及肺组织TNF-α含量显著高于对照组。TNF-α主要由单核巨噬细胞在内、外毒素、补体碎片及多种细胞因子刺激下产生。哮喘时TNF-α升高主要与单核巨噬细胞被激活并释放大量细胞因子有关。TNF-α作为前炎因子可促进多种粘附分子和炎性介质的合成与释放，加重气道炎症和高反应性。如前所述，ET的生成与TNF-α的刺激有关^［4］。可以认为，TNF-α除本身所具有的炎性介质作用外，更主要是作为各种细胞因子的启动剂而参与哮喘的发病过程。

　　在生理状态下，SOD在体内自由基清除系统中起关键作用，不断解除超氧阴离子()所引起的连锁反应，保护细胞免受自由基损伤。但本组实验显示，哮喘患者血浆和豚鼠模型血浆及肺组织MDA显著高于对照组，SOD则显著降低，提示自由基生成明显增多。哮喘时大量炎细胞被激活是生成氧自由基的基础。激活的巨噬细胞和其它炎细胞耗氧量明显增加，产生呼吸爆发而生成大量氧自由基。哮喘所致组织缺氧也可引起线粒体损伤和释放增多，最终导致SOD降低。

　　皮质激素是最强的抗炎剂。本组研究显示给予豚鼠模型雾化吸入氟美松后，增高的ET-1、TNF和MDA含量显著降低，甚至低于正常水平，而SOD活力增高，表明皮质激素可通过抑制炎细胞的活化、迁移，进而减少细胞因子及氧自由基的生成和释放，发挥其有力的抗炎作用。

　　生理状态下低浓度的NO具有舒张血管和支气管的功能，而在炎症等病理情况下过量生成的NO则具有细胞毒性作用。NOS是NO合成的限速酶。文献报道及笔者的实验（另文报道）表明，哮喘发作时NO生成显著增多，L-NAME通过抑制NOS可使NO合成减少；本组实验显示L-NAME亦可使增高的ET-1、TNFα和MDA降低，SOD活力增高。推测在哮喘发病过程中，体内 NO/ET之间可能存在相对平衡。由于L-NAME抑制NO生成，使体内NO/ET的相对平衡重新构建，ET生成减少。 Crawley等^［3］也发现ET-3对大鼠肺血管的作用可被另一种NOS抑制剂L-NMMA减弱，认为ET-3的作用部分由NO的释放所介导。在病理情况下，诱导型NOS(iNOS)主要是在TNF-α等因素刺激下产生并发挥作用，另一方面NOS抑制剂也可能抑制TNF-α的过量生成，减少TNF-α诱导的一系列炎症反应。NO有一未配对电子具有顺磁性，极易与O^-₂结合形成超氧化氮阴离子(OONO^-)，OONO^-及其反应中间产物OONOH^-是极强的氧化剂，可导致脂质过氧化和巯基氧化，从而产生细胞毒性^［2］，表现为生物膜损伤、内皮功能受抑及肺血管舒缩障碍及花生四烯酸代谢产物增多等，可使炎症反应及哮喘症状加重。本组实验显示用L-NAME处理后，豚鼠哮喘模型氧自由基生成减少。这可能与L-NAME有效地抑制i-NOS并阻止其电子传递，从而抑制氧自由基生成有关。另外，NO降低亦使OONO及其分解产物OH^-等自由基减少。Rubanyi等也观察到L-NAME可降低血管平滑肌生成，和SOD一样可减轻免疫复合物所引起的肺损伤^［5，6］。

　　综合上述观点，可以认为哮喘时ET-1、TNF-α和氧自由基及其与NO的反应产物在引起气道炎症反应、支气管收缩和组织损伤中可能起重要作用。L-NAME除可减少NO过度生成外，也能减少ET-1、TNF-α和氧自由基生成，这方面作用与皮质激素相似。这为探索哮喘治疗的新途径提供了线索。

　　参考文献

　　1　Nagase T, Fukuchi Y, Jo C, et al. Endothelin -1 stimulates arachidonate 15-lipoxygenase activity and oxygen radical formation in the rat distal lungs. Biochem Biophs Res Commun, 1990, 168: 485-489.

　　2　Beckman JS, Beckman TW, Chen J, et al. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite. Proc Natl Acad Sci, 1990, 87: 1620-1624.

　　3　Crawly DE, Liu SF, Barnes PJ, et al. Endothelin-3 is a potent pulmonary vasodilator in the rat . J Appl Physiol, 1992,72:1425-1431.

　　4　Allegra L, Riva G, Mezzetti M, et al. Release of endothelin from human bronchial epithelial cells and pecific binding on human bronchial smooth muscle cells in culture. Am Rev Respir Dis, 1990,141:290.

　　5　Rubanyi GM, Vanhoutte PM. Superoxide anion and hyperoxia inactivate endothelium derived relaxing factor. Am J Physiol 1986, 250: 822-827.

　　6　Rubanyi GM, Vanhoutte PM. Oxygen-derived free radicals, endothelium, and responsiveness of vascular smooth muscles. Am J Physiol, 1986, 250: 815-821.

(收稿：1997-09-12　　修回：1997-12-16)