哮喘嗜酸性粒细胞凋亡与抗凋亡
中华结核和呼吸感染 1998年第10期第21卷 综述
作者：毕玉田 杨肇亨
单位：400042 重庆，第三军医大学大坪医院呼吸科
哮喘的气道炎症以嗜酸性粒细胞(EOS)持续聚集为特征，当EOS被激活后，可诱发哮喘时组织的损害。EOS性炎症的消退与临床哮喘的改善有关，但气道EOS清除的机制仍不清楚。细胞凋亡——一种程序化细胞死亡(PCD)的形式，在促进炎细胞清除和炎症的消退方面起关键作用［1］。EOS凋亡在临床上可能与促进EOS清除、改善哮喘临床症状有关。体外研究提示，EOS可发生凋亡并被巨噬细胞作为完整细胞吞噬［2］。体内研究亦证实哮喘发作患者在激素治疗后EOS凋亡增加，EOS凋亡的增加与哮喘临床症状的改善和EOS性炎症减退相关［3］。这些结果提示，凋亡是哮喘EOS性炎症减轻的一个机制。一系列体内外研究提示，EOS凋亡及其调控在哮喘发病过程及其控制中起重要作用。
一、细胞因子表达和EOS凋亡
过度表达白细胞介素5(IL-5)的转基因鼠发生EOS增多。在人类某些疾病也证实上述观察结果。例如，在哮喘证实存在活化T细胞，这些活化T细胞通过释放可溶性产物而调节EOS功能，包括EOS存活因子IL-5、白细胞介素3(IL-3)、粒-巨噬细胞集落形成细胞(GM-CSF)等在支气管哮喘中均见表达增加，这些细胞因子通过抑制细胞凋亡而显著促进EOS生存，这至少在体外实验中获得大量证明［4，5］。Simon等［6］由此提出假设，认为细胞因子抑制EOS程序化死亡在EOS增多中起关键调节作用。
由高EOS供者对EOS进行的分析并不能证实EOS在体外存活的时间更长［7］。也有实验提示，只有在某些因子持续存在条件下，才能使EOS生存延长。因此，人们认为可能某些细胞因子过度表达确实在体内抑制EOS凋亡，通过直接标记EOS或分析抗凋亡基因的表达可获得直接证据，并提出某些因子可能直接启动EOS凋亡信号，如Simon等［6］提出EOS可能同时受凋亡信号与抗凋亡信号的调控。研究表明，细胞因子表达与EOS凋亡直接相关，在哮喘发生、发展及其结局中起重要作用。
二、EOS抗凋亡因子
促EOS生长因子，亦即EOS抗凋亡因子，为IL-5、GM-CSF、IL-3，其作用强度依次为可溶性白细胞介素5(hIL-5)、hGM-CSF和hIL-3，这可能与成熟EOS细胞表面表达的相应受体数目有关。Yamaguchi等建立了一种液体培养体系，即将分离的EOS按106/孔培养于24孔组织培养板，以RPMI1640(含20%小牛血清)为培养基，在不同集落刺激因子(CSFs)作用下，计数活细胞及死细胞数目。在该体系中，以适量hIL-5或hGM-CSF作用，人成熟EOS并不增生，仅仅维持存活状态，表明该体系非常适用于阐明成熟血细胞的生存及死亡过程。通过应用该系统分析了人成熟EOS的凋亡途径［5］。结果表明，IL-5最突出的特征为阻止成熟EOS dNA发生片段化，证明hIL-5促进EOS存活是通过抑制DNA断裂而实现。放线菌素D(ACTD)或放线菌酮(CHX)则消除IL-5此种促EOS生存作用，推测IL-5可能刺激成熟EOS产生某些蛋白抑制核酸内切酶活性。进一步研究表明，EOS与hIL-5、hGM-CSF或hIL-3共育，可观察到EOS产生明显RNA、蛋白质合成，但无DNA合成，说明成熟EOS并未发生增殖，hIL-5促进EOS生存延长与IL-5刺激新蛋白的合成相关。
目前尚未鉴定何种核酸内切酶参与凋亡EOS细胞的DNA裂解。由地塞米松诱导的T细胞系凋亡鉴定出一种组蛋白增加，而bcl-2转基因促IL-3依赖细胞株存活，有可能bcl-2或变异型组蛋白直接或间接参与IL-5诱导的EOS凋亡抑制活性。
由于人类细胞所有活性均由ATP供能，而主要的供能酶为线粒体内膜ATP合成酶，因此，人们提出hIL-5可能调控线粒体某些ATP合成酶的转录，但尚需进一步研究。
不同于其它细胞类型，目前关于粒细胞死亡的遗传调控机制的研究尚起步不久。而粒细胞凋亡似乎并不需要基因的从头表达［4］，提示所有的“死亡”相关蛋白均存在于成熟细胞。另一方面，细胞因子抑制EOS凋亡，也可能诱导抗-死亡基因。这些发现有利于对这类基因进行鉴定。确实，以GM-CSF处理的EOS与新鲜分离的EOS相比，IL-8基因的表达高度上调。然而迄今尚无证据表明IL-8基因表达阻止EOS凋亡过程。因此，尽管某一特殊基因的表达与凋亡抑制相关，但这些现象并不总是具有直接的关系［6］。
抑制凋亡的另一候选者可能为原癌基因bcl-2产物，已知它可诱导多种细胞类型(PCD)。Lagasse等［8］研究了中性粒细胞bcl-2的过表达，转基因模型表明bcl-2阻止中性粒细胞凋亡，但对其吞噬作用无影响。
三、EOS凋亡因子
1.Fas抗原介导EOS凋亡：Fas为表达于细胞膜的一种跨膜蛋白，最初由抗-Fas、抗-Apo-1单抗鉴定，分别称之为Fas受体及Apo-1分子，序列分析表明Fas、Apo-1为分子量36 kd的同一种细胞膜分子，由胞外区、穿膜区及胞内区组成。序列同源性及胞外区所含半胱氨酸的特点，表明Fas为肿瘤坏死因子/神经生长因子(TNF/NGFR)家族成员，现命名为CD+95分子。
Fas基因定位于人10q24.1，定位于小鼠第19号染色体。在转录水平的不同拼接可产生不同形式Fas分子，亦有可溶性Fas分子存在，从而在细胞凋亡中起调节作用。Fas较广泛地分布于多种类型的细胞，在维持组织正常生长发育、控制免疫反应、调节生理平衡中起重要作用［9］。
近年来，在人及鼠EOS也发现Fas R蛋白表达［10，11］。Hebestreit等［12］的研究发现，新鲜分离的人外周血EOS组成性表达Fas r mRNA，以IL-5、GM-CSF刺激后其Fas表达并未受影响。此外，由正常个体及EOS增多患者来源的EOS其Fas表达也未见不同。抗-Fas单抗诱导新鲜分离的正常人EOS发生凋亡。与正常个体EOS相比，由EOS增多患者分离的EOS其中大约30%不表达功能性FasR。在这些患者中，EOS对抗Fas单抗诱导凋亡的敏感性下降，这并不是因为EOS表面无FasR表达;而这些EOS仍对GM-CSF刺激起反应，可抑制EOS的细胞凋亡反应,提示这些EOS对调节凋亡的信号并非完全无能。为了进一步探讨在慢性EOS炎症条件下Fas介导的细胞凋亡，他们采用鼻息肉组织进行实验。鼻息肉具有明显的EOS浸润，类似于哮喘患者肺组织EOS浸润。培养的鼻息肉组织EOS在3天内未见发生凋亡；而所有外周血EOS发生凋亡，提示在该组织培养体外系统EOS接受生存信号。抗-Fas单抗诱导部分鼻息肉组织EOS凋亡，但仍见有大量EOS浸润，为非凋亡的EOS。这些对抗-Fas单抗呈凋亡抗性的EOS未见EOS表面Fas蛋白表达下降。
Druilhe等［13］动态检测了处于细胞不同培养时期EOS表面Fas的表达。通常由培养液中撤除细胞因子的EOS显示非活力状态，并以时间依赖方式发生凋亡，在2～4天内死于细胞凋亡。动态学研究表明，EOS培养早期，EOS同时发生凋亡与非凋亡性死亡。在细胞培养初期，仅检测EOS含微量Fas mRNA，培养时间延长(48～72小时)EOS表面Fas表达更易于检测到。推测EOS培养早期发生凋亡可能是由于：(1)产生的Fas配体与组成性表达于EOS的Fas结合而启动凋亡；(2)bcl-2含量下降，因而阻止凋亡的能力下降。抗-Fas单抗处理的EOS以流式细胞检测发现明显的、剂量依赖性细胞凋亡征。EOS表面Fas表达量与其凋亡敏感性的比较发现，在培养48小时后，Fas表达增加，但培养6～12小时EOS对抗-Fas诱导的凋亡更为敏感，可能EOS培养早期细胞表面Fas为功能性抗原受体，因而更易于对抗-Fas抗体产生凋亡反应。这些EOS凋亡小体由M吞噬，因而经抗-Fas单抗刺激后可见M数目增加，从而避免了死亡EOS炎性介质释放造成的损伤效应［5］。
这些结果提示：(1)正常人EOS组成表达Fas R，抗-Fas单抗诱导Fas+ eOS凋亡，表明正常人EOS表达功能性Fas抗原。(2)在细胞培养不同阶段，EOS表达Fas抗原量不同，且Fas抗原表达量与其凋亡敏感性无明显正比关系，提示存在凋亡与抗凋亡间平衡，可能为调控体内EOS活化状态及数目的机制。(3)部分哮喘患者由于EOS表达非功能性Fas抗原，EOS细胞凋亡机制失衡，导致大量EOS炎性浸润而发病。(4)是否存在Fas配体表达异常，不能介导表达功能性FasR的EOS产生凋亡而导致哮喘发病，是另一个令人感兴趣的问题。
2.糖皮质激素促EOS凋亡作用：Woolley等［3］证实激素治疗后EOS凋亡增加，这也是首次探讨激素在人类疾病中对EOS凋亡的体内作用的研究。体外实验证实，地塞米松在＞0.01μmol浓度时于12小时内促进EOS凋亡。糖皮质激素在支气管哮喘的治疗中占有重要地位。氢化可的松可使支气管局部EOS数目下调，并阻止IL-3、IL-5、GM-CSF介导的EOS存活延长，从而缓解病情。机制在于糖皮质激素抑制淋巴细胞、炎症细胞和其它免疫细胞、细胞因子的转录。通过下调IL-3、IL-5、GM-CSF的表达，从而拮抗EOS活化因子IL-3、IL-5、GM-CSF的功能作用。它的另一个主要作用机制为干扰一系列凋亡信号，包括Fas抗原的活化。研究表明，地塞米松尽管对Fas抗原表达无影响，但加强由抗-Fas单抗诱导的EOS凋亡，因此它参与了EOS凋亡信号途径，并与EOS表面Fas活化相关［13］。由于Fas抗原参与EOS凋亡，这对哮喘治疗提供了新的治疗前景。
3.环孢菌素A(CyA)促EOS凋亡作用：已证实啮齿动物受变应原刺激后，以CyA处理可抑制EOS［14］。对于依赖激素治疗的严重哮喘患者，CyA有利于缓解病情［15］。由于CyA具有免疫抑制作用，通常认为CyA对EOS的抑制效应在于减少细胞因子的产生，如通过抑制IL-5的生成而抑制哮喘EOS功能活性。但与CyA对IL-2的作用相比，它抑制IL-5的生成极弱［16］。Kitagnki等［17］以大鼠哮喘为模型证实，CyA在0.1μmol即明显促进EOS凋亡。他们认为尽管CyA可抑制Th2产生IL-5等细胞因子，但该作用十分轻微，可能并不是CyA促EOS凋亡的主要机制，而TGFβ1更可能参与CyA促EOS的凋亡作用。这是由于TGFβ可诱导EOS凋亡［18］，而CyA为刺激EOS产生TGFβ的强诱导剂［19］。Kitagnki等［17］还发现CyA在多种细胞因子存在下也诱导EOS凋亡，提示CyA可能作用于细胞膜及(或)细胞内信号传导途径，如参与蛋白质酪氨酸磷酸化的调节过程。
4.TGFβ促EOS凋亡作用：TGFβ为一多功能细胞因子，可促进组织细胞功能，但通常抑制炎症部位浸润细胞的生长与活性。TGFβ可抑制EOS由骨髓细胞的分化。Alam等［18］认为TGFβ是EOS存活的内源性负调控因子，TGFβ抑制EOS存活的机制可能为阻止促EOS生长因子的合成并诱导凋亡。他们发现TGFβ可抑制EOS合成GM-CSF和IL-5，但并不影响EOS细胞表面GM-CSFR的表达。中和性抗TGFβ抗体可延长EOS存活，而由EOS增多患者分离的EOS可检测出TGFβ的表达［20］，提示EOS可自分泌TGFβ。EOS产生TGFβ与细胞生成素间可能存在精细平衡，TGFβ可能为一造血调控因子，对抗细胞生成素的作用，使EOS发生程序化死亡［15］。除了抑制细胞因子合成及EOS存活，TGFβ还阻止EOS释放过氧化物酶，下调EOS细胞株(Eol-1)CD+23的表达，表明TGFβ对EOS生长、分化、功能及存活各方面均有抑制作用［18］。
毫无疑问，EOS凋亡及其调控在哮喘发生、发展中起重要作用。细胞凋亡为机体正常生理过程，在EOS分化、成熟的各个环节，如骨髓前体细胞EOS分化阶段、血液EOS成熟阶段及EOS局部组织活化阶段，均通过EOS凋亡产生精细调控作用，从而控制EOS数目及功能。EOS调节受控于凋亡诱导因子与抗凋亡因子之间的平衡。因此，在EOS分化、成熟的任一环节出现凋亡因子与抗凋亡因子的失衡，如抗凋亡因子（IL-3/IL-5/GM-CSF、bcl-2）等过度表达、凋亡诱导因子（Fas、TGFβ）等缺损或非功能性表达同时存在，均可能成为导致哮喘或其它变态反应性疾病中EOS增多的重要原因。对EOS凋亡及其调控的认识，有可能帮助从诱导特异的EOS凋亡的角度寻找治疗药物或设计新药，对哮喘患者或其它EOS增多患者进行有效治疗。
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(收稿：1997-11-26 修回：1998-03-25)
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