哮喘豚鼠免疫治疗初步观察

中华结核和呼吸感染 1998年第12期第21卷 论　　著

作者：史皆然　孙滨　战兴利

单位：710032 西安，第四军医大学西京医院呼吸内科

　　关键词： 白细胞介素；单克隆抗体；哮喘；动物，实验

　　【摘要】　目的　初步观察抗白细胞介素5（IL-5）单抗对哮喘豚鼠嗜酸性粒细胞（EOS）的影响。方法　用鸡卵清蛋白(OVA）腹腔注射法复制豚鼠哮喘模型，随机分为两组，每组15只，联合应用雾化吸入和腹腔注射法分别给予生理盐水（NS）及抗IL-5单克隆抗体（McAb）治疗，比较基础、治疗前、后外周血(PB)和支气管肺泡灌洗液（BALF）中EOS的改变。结果　 McAb治疗组豚鼠外周血EOS计数治疗前［(1.76±0.27)×10⁹/L］与治疗后［(1.63±0.26)×10⁹/L］比较，差异有显著性（P＜0.05），而NS组则无明显改变（P＞0.05）；治疗后McAb组BALF中EOS数［(0.41±0.06)×10⁹/L］与NS组［(0.46±0.07)×10⁹/L］比较，差异有显著性(P＜0.05)。结论　该抗IL-5单抗具有下调外周血和气道EOS功能。

Preliminary observation of immunotherapy on asthmatic guinea pig

Shi Jieran, Sun Bin, Zhan Xingli. Respiratory Department, Xijing Hospital, Xi′an, 710032

　　【Abstract】　Objective　To observe the effect of the anti-IL-5 monoclonal antibody(McAb) on eosinophils of the guinea pigs with asthma.Method　Sensitized guinea pigs by OVA were divided into two groups randomly, which were treated with the McAb and normal saline (NS), respectively. Difference of peripheral blood eosinophil count (PBEC) among basal、pre-treatment and post-treatment, and the difference of bronchoalveolar lavage fluid eosinophil count (BALFEC) between two groups above were compared.Result　The PBEC after treatment with the McAb ［(1.63±0.26)×10⁹/L］ was lower than that before treatment ［(1.76±0.27)×10⁹/L］ (P＜0.05) and the BALFEC of treatment group with the McAb was lower than that with NS ［(0.41±0.06)×10⁹/L vs. (0.46±0.07)×10⁹/L］ (P＜0.05).Conclusion　The anti-IL-5 McAb has the ability to reduce the PBEC and the BALFEC.

　　【Key words】　Interleukins　　Monoclonal antibodies　　Asthma　　Animals, laboratory

　　哮喘是一种慢性气道炎症，许多细胞和因子参与其炎症的发生和发展^［1］。

　　白细胞介素5（IL-5）在嗜酸性粒细胞（EOS）分化、成熟、活化和募集至气道以及辅助B淋巴细胞产生抗体（IgE、IgA）等过程中^［2～4］，起重要的调节作用。因此是哮喘发病中极为重要的一环。

　　调整IL-5在外周血和局部组织中的水平，将有可能预防和控制哮喘的发作。动物实验表明^［5～7］，抗IL-5单克隆抗体(McAb)不仅能抑制EOS在肺内的浸润，而且能够完全抑制气道高反应性的发生。这不仅有力地证明了IL-5在哮喘发病中的关键作用，而且为哮喘的治疗开辟了新的途径。我们的研究采用自制抗IL-5单克隆抗体用于哮喘动物模型，以初步观察其对EOS的影响。

材料与方法

　　1.材料：抗IL-5单克隆抗体（自制）；鸡卵清蛋白（OVA）由上海化学试剂厂产；PARI BOY雾化器（德国百瑞公司）；雄性豚鼠30只，体重每只＞350 g（本校动物中心）。

　　2.方法:(1)动物模型制备：参照文照［7］按30 mg*kg^-1给豚鼠腹腔注射OVA抗原液，2周后追加免疫1次。末次注射10天后，以2%的OVA溶液雾化激发，观察致敏效果。对已致敏的豚鼠，间隔1天激发1次，共8次，使其成为慢性哮喘模型备用。(2)治疗：将致敏豚鼠随机分为两组，McAb组15只，NS组15只，同时于激发前3天分别给以生理盐水及抗IL-5单克隆抗体每只2 ml(1∶10稀释)雾化吸入，2次/天；每只腹腔注射(每只0.5 ml，约0.2 mg)，1次/天。(3)采集标本：分别于致敏前、后和治疗前、后经心脏采血1 ml，用于计数EOS。于末次采血后切开颈部皮肤，钝性分离出气管，横向剪一小口，插入外径2.5 mm的塑料管并固定，以2.94 kPa(1 kPa=10.2 cmH₂O)的压力经气管插管行支气管肺泡灌洗(BAL，0.15% NaCl 80 ml，EDTA 2.6 mmol/L温浴至37℃)。收集支气管肺泡灌洗液(BALF)经双层纱布过滤后行细胞分类计数。(4)嗜酸性粒细胞计数：取20 μl待检标本加入0.38 ml EOS计数液(95%乙醇30 ml、甘油10 ml、碳酸钠1.0 g、枸橼酸钠0.5 g、伊红0.2 g加水至100 ml)中，静置5分钟后，于细胞计数板上计数EOS。

　　3.统计学处理：采用x±s表示，组间比较采用t检验，组内比较采用方差分析。

结果

　　激发后各组豚鼠不仅出现打喷嚏、呼吸频率加快等哮喘发作的表现，而且外周血中EOS数也明显高于致敏前水平，McAb组和NS组分别由致敏前的(0.81±0.25)×10⁹/L和(0.73±0.26)×10⁹/L升高至治疗前的(1.76±0.27)×10⁹/L和(1.78±0.25)×10⁹/L，两组比较差异有显著性(P＜0.01，表1)，说明各组动物致敏成功。激发数次后引起的EOS改变，成为稳定的哮喘模型。NS组在激发过程中有3只死亡。经抗IL-5单克隆抗体治疗后豚鼠外周血EOS数仍显著高于基础水平(P＜0.01)，但较治疗前明显降低(P＜0.05)，而NS组则无明显改变(P＞0.05)。与此同时，抗IL-5单克隆抗体McAb组BALF中EOS数也较NS组明显降低，分别为(0.41±0.06)×10⁹/L和(0.46±0.07)×10⁹/L，两组比较差异有显著性(P＜0.05，表2)。

表1　两组动物各阶段外周血中EOS计数(x±s)

　　注：表中所列数值为同一标本计数5次，去除其中最高和最低值后的平均值，^*与致敏前比较P＜0.01，^△与治疗前比较P＜0.05，^▲与治疗前比较P＞0.05

表2　两组动物BALF中EOS计数(x±s)

　　注：^*统计时剔除了混有血液的标本(治疗组和对照组各1例)

讨论

　　临床发现，外周血和局部组织中IL-5水平升高与哮喘发作密切相关。IL-5是由活化CD⁺₄淋巴细胞分泌，一方面对EOS的分化、成熟、趋化、活化以及延长其存活等方面起着重要的调节作用；另一方面能促进B细胞的分化和抗体的产生，即在IL-6的参与下，促进粘膜分泌性IgA（sIgA）的产生^［8］和辅助IL-4促进IgE的合成^［2］。IgE介导了肥大细胞脱颗粒，引起速发相哮喘反应^［3］；而sIgA则介导EOS脱颗粒，引起迟发相哮喘反应^［9］。 这说明IL-5在哮喘的发生发展中占有重要的地位，也提示人们从调节IL-5水平的角度去探索哮喘治疗的新途径。

　　Nakajima等^［5］用抗IL-5单克隆抗体给致敏豚鼠注射后，再以过敏原激发，发现该鼠气道内的EOS数较注射前明显减少。而Ohnishi等^［6］发现，将过敏原肺段激发者的BALF用抗IL-5单克隆抗体进行预处理后，其对EOS存活力的延长作用被完全抑制。Antoon等^［7］发现，鼠源性抗IL-5单克隆抗体能明显抑制EOS在气道内的浸润，同时也完全抑制气道高反应性的发生。这说明了IL-5对促进EOS增殖和募集至气道有重要的调节作用。

　　我们用人工合成的IL-5片段作抗原免疫小鼠，经融合获得了7株杂交瘤细胞，将其中2H10分泌的McAb用于哮喘豚鼠的治疗，获得了与Antoon等相近的结果，说明该抗体具有抗IL-5的中和活性，同时也证实了可以用人工合成的IL-5多肽片段作为IL-5替代物的设想。

　　从表1中不难看出，治疗后抗IL-5单克隆抗体组豚鼠外周血EOS数没有回落到基础水平，分析认为可能有以下原因：(1)抗体的特异性不高；(2)豚鼠的IL-5与人和小鼠也存在一定的差异。无论McAb组还是NS组，治疗后再次激发均出现哮喘发作，我们认为，这主要是通过IgE介导的速发反应。实验中发现，以同样浓度的抗原激发，McAb组出现喘息所需时间较NS组长(资料未显示)，分析认为是由于IgE和EOS在外周血和组织局部的半寿期不同造成的。因为48小时以上的腹腔注射加雾化吸入治疗，使气道和循环中的IL-5水平发生一定程度的下降，IgE因半寿期较短而浓度很快降低，而EOS因其半寿期较长，数量变化不大。这正是McAb组BALF中EOS数虽较NS组明显减少，但仍显著高于基础水平的原因。EOS数量和功能的改变尚需进一步实验观察。

　　本课题受国家自然科学基金资助(基金编号：39470324)

参考文献

　　1　孙滨. 哮喘发病机理及治疗进展.中华结核和呼吸杂志，1993，16（增刊）:1-2.

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　　3　Rousset F, Robert J, Andary M, et al. Shifts in interleukin-4 and interferon-γ production by T cell of patients with elevated serum IgE levels and the modulatory effects of these lymphokines on spontaneous. J Allergy Clin Immunol，1991，87:58-69.

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　　6　Ohnishi T. IL-5 is the predominant eosinophil-active cytokine in the antigen-induced pulmonary late-phase reaction. Am Rev Respir Dis，1993，147: 901-907.

　　7　Antoon J, Nijkamp F. Effect of anti-IL-5 and IL-5 on airway hyperreactivity and eosinophils in guinea pigs. Am Rev Respir Dis，1993，147: 548-552.

　　8　Kroegel C, Virchow C, Kortsik C, et al. Cytokines, platelet activating factor and eosinophil in asthma. Respir Med，1992，86: 375-389.

　　9　Kita H, Ghazaleh AR, Sanderson C, et al. Effect of steroids on immunoglobulin-induced eosinophil degranulation. J Allergy Clin Immunol，1991，87:70-77.

(收稿：1998-01-10　　修回：1998-06-05)