肿瘤坏死因子mRNA在哮喘患者诱导痰中的表达及其与病情严重程度的关系

中华结核和呼吸感染 1999年第3期第22卷 论著摘要

作者：赵海涛　钟南山　徐军

单位：110015 沈阳，沈阳军区总医院呼吸科(赵海涛)；广州呼吸疾病研究所(钟南山、徐军)

　　选取哮喘组患者15例，男9例，女6例，平均年龄31±9岁，所有患者试验前1年内未经静脉或肌注糖皮质激素治疗，除3例急诊患者外，均予肺功能检查及组胺激发试验或沙丁胺醇舒张试验，其中轻度7例，中度4例，重度4例（按WHO分类法）；对照组15名，男12名，女3名，平均年龄21±10岁，均为男性非吸烟者；慢性支气管炎(慢支)组患者8例，男6例，女2例，年龄62±9岁。通过雾化吸入3%高渗盐水留取受检者诱导痰^［1］3～4口，少许痰液涂片应用吉姆萨染色进行细胞分类计数，余下痰液经10%连硫苏糖醇溶液处理后，少部分在光镜下进行细胞总数计数，其余用异硫氰酸胍一步法^［2］提取细胞总RNA，在紫外分光光度仪上测定其A值［曾称光密度OD值］进行定量。取1 μg细胞总DNA进行反转录合成cDNA^［3，4］，反应底物为10×反转录缓冲液、5 mmol/L 氯化镁、1 mmol/L 4种dNTP混合物、20单位胎盘RNase抑制剂、0.2 μg 15-寡胸腺嘧啶核苷酸随机引物、20单位AMV反转录酶。反应条件为：25℃ 5分钟，42℃ 60分钟，99℃ 10分钟，反应完成后取反转录混合产物4 μl与10×PCR缓冲液、2 mmol/L氯化镁、0.4 mmol/L dNTP，3.7 kBq α-³²磷dCTP及200 ng β肌动蛋白(β-actin)与肿瘤坏死因子α(TNF-α)上游和下游引物混合在PCR扩增仪上进行反应，反应总体积为50 μl，反应条件为：β-actin：95℃ 1分钟，60℃1分钟，72℃ 2分钟；TNF-α：95℃ 45秒，65℃ 45秒，72℃ 90秒，两者皆30个循环，最后72℃延伸10分钟，4℃保存备用。β-actin 和TNF-α引物序列分别为：β-actin上游引物^［5］：5′ATGGATGATGATATCGCCGCG 3′；下游引物： 5′CTCAGAAGCATTTGC-GGTGGACGATGGAGGGGCC 3′；TNF-α上游引物^［6］：5′ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGG3′；下游引物： 5′GCAATGATCCCAAAGTAGAC-CTGCCC3′。取20 μl PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1×Tris-乙酸（1×TAE），以0.5 μg/ml的溴化乙锭（EB）作为标记，在紫外灯下切下含有荧光条带的凝胶（β-actin为1126 bp，TNF-α为691 bp），应用液体闪烁仪进行测量^［8］，TNF-α mRNA的表达量以TNF-α/β-actin衰变率比值(次/分)来表示。

　　实验数据用±s表示，两组间比较采用t检验，两组间相关性采用直线相关分析。

　　结果　(1)哮喘组痰嗜酸粒细胞相对计数百分数(20.1±3.4)%显著高于慢支组(0.7±0.3)%和正常对照组(1.4±0.5)%(P＜0.01)；而慢支组巨噬细胞相对计数百分数(67±18)%显著高于哮喘组(51±10) %，P＜0.05。哮喘组TNF-α mRNA的表达量(1.31±0.95)明显高于正常组(0.10±0.21，P＜0.01)，而与慢支组(1.02±0.91)比较差异无显著性(P＞0.05)。哮喘组TNF-α mRNA的表达量与其病情的严重程度呈正相关(r=0.81,P＜0.01)，与痰中嗜酸粒细胞百分比呈正相关(r=0.64,P＜0.05)。

　　讨论　利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定痰标本中细胞因子mRNA的表达水平，全部试验的关键步骤在于细胞总RNA的提取，这也是本试验的基础，迄今为止未见系统的报道。本组实验采用连硫苏糖醇处理痰标本，异硫氰酸胍一步法抽提细胞总RNA，有相当部分标本可以成功地扩增出所需的PCR产物。试验发现，哮喘组TNF-α mRNA的表达量与正常对照组比较有明显差异，且与患者痰中嗜酸粒细胞百分比及其病情严重程度呈正相关，提示痰中TNF-α mRNA表达量的增高可能预示着气道炎症，特别是嗜酸粒细胞炎症的严重程度。另外，哮喘患者与慢支患者比较TNF-α mRNA表达量无明显差异，说明TNF-α作为一种炎症因子，在哮喘炎症的发生、发展过程中的作用是非特异性的。由于痰标本取材方便，患者易于接受，痰中TNF-α mRNA表达量有可能作为临床气道抗炎治疗效果的参考依据。

　　参考文献

　　1　Pin I, Gibson PG, Kolendowicz R, et al. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax，1992，47:25-29.

　　2　王申五，白桃. 细胞总RNA的制备.见：王申五，主编.基因操作技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991.46-48.

　　3　Innis MA，Gelfand DH，Sninsky JJ, et al. Optimization of PCRs. In: Innis MA，ed.PCR protocols: a guide to methods and applications. San Diego ：Academic press inc, 1990. 3-13.

　　4　吴卫星，杨瑞馥.RNA的扩增.见：林万明，主编. PCR技术操作和应用指南.第2版. 北京：人民军医出版社，1993.63-65.

　　5　Ponte P, Engel J. Evolutionary conservation in the untranslated regions of the actin mRNAs: DNA sequence of the human beta-actin cDNA. Nucleic Acids Res, 1984，4：1687-1696.

　　6　Krishnaswamy G, Liu MC, Su SN, et al. Analysis of cytokine transcripts in the bronchoalveolar lavage cells of patients with asthma. Am J Resp Cell Mol Biol，1993，9: 279-286.

　　7　张晨晖，李倩虹，张继峰，等.一氧化氮合成酶（NOS）基因表达的半定量检测及其应用.北京医科大学学报，1994，26增刊：15-20.