吸入肝素对哮喘豚鼠气道炎症影响的研究
中华结核和呼吸感染 1999年第9期第22卷 论著摘要
作者：谷伟 孙丽华 张祖贻 陈真如 季寿琪
单位：210006 南京，南京医科大学附属第一医院呼吸科(谷伟、孙丽华)；南京铁道医学院(张祖贻、陈真如、季寿琪)
肝素在临床上作为抗凝剂而广泛使用。然而很多证据显示，肝素还有非抗凝血的生物学功能,包括抗炎、免疫调节、抑制过敏反应等。我们通过抗原激发形成哮喘豚鼠模型，以肝素雾化吸入治疗，研究肝素对哮喘豚鼠气道炎症的影响，探讨肝素抗哮喘的机制。
材料与方法 健康豚鼠60只。雌雄不限，体重300～450 g，随机分为三组：哮喘模型组（A组，20只）：用5 % 卵蛋白生理盐水注射于豚鼠后腿肌肉，每侧0.4 ml，同时腹腔注射1 ml。2周后将豚鼠置于面罩内，给与1%卵蛋白生理盐水雾化吸入20秒；肝素治疗组（B组，20只）：模型制备同A组，吸入卵蛋白前30分钟，给与250 U/ml肝素雾化吸入（1 000 U/kg）；对照组（C组，20只）：给予生理盐水注射，2周后雾化吸入生理盐水。在卵蛋白雾化吸入后17小时，每组随机取10只豚鼠进行支气管肺泡灌洗，将所得支气管肺泡灌洗液（BALF）离心，1 500 r/min，细胞成份悬浮于1 ml的Hank溶液中，光镜下计BALF中细胞总数，另将沉淀细胞成份即刻涂片，吹干进行Wright-Giemsa染色，高倍镜下至少计数300个细胞，计算出巨噬细胞（MΦ）、中性粒细胞（N）、淋巴细胞（L）、嗜酸细胞（EOS）、上皮细胞（Ce）所占的百分数。另外10只豚鼠气管内灌注10 % 甲醛至肺表面膨胀，然后肺组织置于甲醛中固定1周，制成石蜡切片，HE染色和甲苯胺蓝染色，用目镜测微尺随机选择0.4～0.8 mm范围内5～10个支气管或细支气管，光镜下计气管壁肥大细胞（MC）、N、单核细胞（M）、EOS。同时每组随机取2只豚鼠，取气管粘膜固定，乙醇脱水，环氧树脂包埋， 超薄切片后在透射电镜下观察超微结构变化。
1 哮喘模型组可见明显肺泡间质炎症、气道上皮脱落、管腔渗出 HE ×200
2 肝素治闻组粘膜膜损伤较轻，管腔炎性渗出很少 HE ×200
表1 三组大鼠BALF中各种细胞成份的变化(×107/L，
±s)
| 组别 |
例数 |
细胞总数 |
巨噬细胞 |
中性粒细胞 |
淋巴细胞 |
嗜酸细胞 |
上皮细胞 |
| A组 |
10 |
78± 9 |
48±10 |
10.4±3.5 |
7.45±2.28 |
7.11±2.32 |
2.88±1.05 |
| B组 |
10 |
66±10* |
43±9 |
7.7±2.9 |
4.48±1.66* |
4.19±2.03* |
1.52±0.88* |
| C组 |
10 |
43±6** |
38±6 |
1.5±0.5** |
1.84±1.00** |
0.80±0.47** |
0.20±0.20** |
注：与A组比较P＜0.01，P＜0.001
表2 三组大鼠支气管或细支气管壁细胞成份的变化(mm2，±s)
| 组别 |
例数 |
肥大细胞 |
单核细胞 |
中性粒细胞 |
嗜酸细胞 |
| A组 |
10 |
23±5 |
0.21±0.07 |
2.4±0.5 |
21.66±4.91 |
| B组 |
10 |
29±3* |
0.23±0.06 |
2.5±0.6 |
6.44±2.21** |
| C组 |
10 |
36±6** |
- |
- |
- |
注：与A组比较P＜0.01,P＜0.001 统计学处理：以±s表示。多样本比较采用方差分析。
结果 BALF中各种细胞成分的变化见表1；支气管或细支气管壁细胞成份的变化见表2；光镜下病理变化和电镜下超微结构的改变见图1～4。
3 哮喘模型组上皮纤毛脱落，游离面可见基体 ×25000
4 肝素治疗组上皮纤毛稍有倒状 ×25000
讨论 肝素由于N-硫酸己糖胺结构与1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）具有一定的相似性，可以特异地、竞争性地和IP3受体结合，从而干扰IP3介导的内源性Ca2+离子释放，减轻MC脱颗粒［1］，本组实验显示，在肝素治疗组支气管和细支气管壁MC数量显著高于哮喘模型组，提示肝素可以抑制MC释放颗粒。
哮喘的多种病理生理改变，可用EOS释放的毒性蛋白来解释［2］，EOS毒性蛋白在体内通过电荷依赖而非受体依赖增加气道高反应性［3］。本组实验发现，肝素治疗组在BALF中Ce数量显著低于哮喘模型组。病理标本上，支气管粘膜上皮未见明显剥脱。电镜下，粘膜上皮未见明显纤毛断裂现象。可能和肝素由于硫酸根的存在，具有很强的负电荷，可以中和EOS毒性蛋白对上皮损伤作用有关。本组实验还观察到，肝素治疗组在支气管和细支气管壁EOS数量显著低于哮喘模型组，其机制不很清楚，可能原因是肝素能抑制血小板激活因子(PAF)，减少EOS在肺组织浸润［4］有关。
另外，在肝素治疗组BALF中淋巴细胞数量显著低于哮喘模型组。其具体机制不明，可能为肝素可抑制激活T细胞对乙酰肝素脂酶的分泌，从而抑制T细胞转运和由T细胞介导的迟发超敏反应［5］。
综上所述，肝素可抑制哮喘豚鼠气道炎症反应，减轻气道上皮损伤，为其临床使用提供理论依据。
参考文献
1 Ghosh TK, Eis PS, Mullaney JM, et al. Competitive ,reversible and potent antagonism of inositol 1, 4, 5-triphosphate activated calcium release by heparin. J Biol Chem, 1988,263: 11075-11079.
2 Oddera S, Silvestri M, Balbe A, et al. Airway eosinophilic inflammation epithelial damage, and bronchial hyperresponsiveness in patients with mild-moderate, stable asthma. Allergy, 1996 ,51:100-107.
3 谷伟.阳离子蛋白与气道高反应性.国外医学呼吸系统分册,1998,18:154-156.
4 Hanss JG, Woods MA, Coyle AJ, et. al. The effect of heparin and related molecules on PAF induced bronchial hyperreactivity and eosinophil infiltration in the guinea-pig (abstract) . Am Rev Respir Dis, 1989,139:134.
5 Lider O, Mekori YA, Miller T, et. al. Inhibition of T lymphocyte heparanase by heparin prevents T cell migration and T cell mediated immunity. Eur J Immunol ,1990, 20: 493-499.
收稿：1998-12-23
修回：1999-03-25
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