血小板活化在哮喘发病中的意义

中华结核和呼吸感染 2000年第6期第23卷 论　　著

作者：衡伟　王光杰　马家用　朱蓉梅　王兆钺　朱明清

单位：衡伟　王光杰　马家用　朱蓉梅(苏州医学院附属第一医院呼吸内科　215006)；王兆钺(血栓室)；朱明清(苏州医学院重点实验室)关键词： 哮喘；血小板活化；血栓烷B₂

　　【摘要】目的　探讨血小板活化在哮喘发病中的作用。方法　利用酶联免疫法及流式细胞仪分别测定62例哮喘患者和18名正常对照者血浆11-去氢血栓烷B₂（11-DH-TXB₂）、血栓烷（TXB₂）浓度和血小板膜CD 62P的表达情况，并利用荧光酶联免疫法测定部分血清嗜酸细胞阳离子蛋白（ECP）水平。结果　症状性哮喘组血浆11-DH-TXB₂浓度为（33.2±2.7） ng/L，血小板CD 62P阳性百分比为（23.8±3.0）%，平均荧光强度为2.75±0.29；与健康对照组和缓解组比较差异有显著性（P分别＜0.01、＜0.05）。缓解期哮喘与健康对照组比较仅血浆11-DH-TXB₂浓度差异有显著性（P＜0.05）。哮喘发作时血小板活化水平与血清ECP及一秒钟用力呼气容积占预计值百分比（FEV₁占预计值百分比）、最大呼气流量（PEF）相关。结论　哮喘发作时存在血小板的异常活化,其活化程度与哮喘气道炎症及病情有一定相关性,血小板可能通过影响嗜酸细胞功能参与哮喘的发病。

The role of platelet activation in the pathogenesis of asthma

HENG Wei，WANG Guangjie,WANG Zhaoyue,et al.(Department of Respirology,The First Affiliated Hospital,Suzhou Medical College，Suzhou 215006,China)【Abstract】Objective　To investigate whether platelets are activated during an asthmatic attack and to detect the correlation between platelet activation and severity of bronchial asthma.Methods　Plasma concentration of thromboxane B₂ (TXB₂) and 11-dehydro-TXB₂ (11-DH-TXB₂) and P-selectin (CD 62P) on platelet surface were measured in 44 patients with asthma and in 18 normal individuals using ELISA and FCP.The serum ECP level and pulmonary function were also analysed.Results　The plasma level of 11-DH-TXB₂ and TXB₂ and the positive percentage of CD 62P on platelets were significantly increased in patients with acute asthma (n=28) as compared with the control (n=18，P＜0.01).The plasma concentration of 11-DH-TXB₂ and TXB₂ were decreased significanty after the control of asthma.The level of platelet activation was correlated with ECP (r=0.785,P＜0.05)，FEV₁%(r=-0.867,P＜0.01 ) and PEF(r=-0.745,P＜0.05).Conclusions　These results suggest that there is an abnormal platelet activation in asthmatics,which can reflect the severity of bronchial asthma to a certain extent,although its exact，mechanism is unknown.The platelets secret a wide range of biologically active substances capable of inducing or augmenting the airway inflammatory responses in asthma.【Key words】Asthma;Platelet activation;Thromboxane B₂支气管哮喘的发病涉及多种炎性细胞，其中嗜酸细胞、淋巴细胞和肥大细胞及其细胞因子的作用已较为确切。近年来随着研究工作的逐步深入，血小板在哮喘炎症中的作用日益受到重视。动物实验表明，耗竭家兔和豚鼠血小板可以明显减轻抗原或血小板活化因子（PAF）所诱导的支气管平滑肌痉挛和气道高反应性。然而有关血小板功能对哮喘或气道高反应性的影响，国内开展的并不多，我们的实验通过酶联免疫法测定哮喘患者血浆11-去氢-血栓烷B₂（11-DH-TXB₂）浓度，并利用流式细胞仪直接测定血小板膜表面CD 62P的表达，旨在探讨血小板在哮喘发病中的意义，以期为哮喘研究和防治开辟一个新的领域。

　　对象与方法一、对象健康对照组18名：男12名，女6名，年龄18～58岁，均为健康体检者，均无明显心、肝、肾等疾病，无过敏性疾病及其它变态反应性疾病。哮喘组28例：男17例，女11例，年龄19～63岁，均有明确的哮喘史为症状性哮喘患者，本次发作有喘息、胸闷、气促、咳嗽等不同程度的症状。均符合1997年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组的诊断标准（修正方案）。哮喘缓解组16例：男9例，女7例，年龄18～53岁，均为经综合治疗后缓解的病例，其中10例哮喘患者为自身治疗前、后的对照。慢性阻塞性肺疾病（COPD）组10例：男6例，女4例，年龄43～72岁，为住院患者，有咳、痰、喘等症状。所有参试者除COPD组外均进行血浆11-DH-TXB₂、血栓烷B₂（TXB₂）和血小板膜CD 62P的测定，部分正常对照者和哮喘患者及COPD组还进行了血清嗜酸细胞阳离子蛋白（ECP）和一秒钟用力呼气容积（FEV₁）、用力肺活量（FVC）和最大呼气流量（PEF）的测定，所有参试对象1周内未服用阿斯匹林类药物。二、主要试剂和仪器DH-TXB₂标准品为法国Caimau公司产品、DH-TXB₂药盒由我院血液病研究所提供、异硫氰酸荧光素（FITC）、FITC标记的抗CD 62P单克隆抗体为法国Coulter-Immuntech公司提供、ECP检测药盒为瑞典Pharmacia公司提供、TXB₂放射免疫检测药盒由我院血栓室制备、磷酸缓冲液（PBS）、肺功能仪（MS PFT型)由德国耶格公司提供，酶联免疫检测仪、流式细胞计数仪（EPICS-XL型)由美国Coulter公司提供，Pharmacia及CAP变应原检测系统由瑞典法玛西雅公司提供。三、测定方法及观察指标1.取样：由肘静脉抽取静脉全血5 ml，其中2 ml加入2 % 乙二胺四乙酸二钠EDTA（Na₂）抗凝（抗凝剂与全血体积比为1∶9），3 000 r/min，离心10 min，取血浆置-20℃冻存待测，另取2 ml注入玻璃试管凝血60 min，取上清亦置于-20℃冻存，最后1 ml也加入2% EDTA（Na₂）轻轻混匀备测。2.DH-TXB₂测定：采用酶联免疫法标板（96孔）以纯化的羊抗兔IgG包被（每孔2 μg）并用牛血清白蛋白（BSA）封闭。测定前倾弃液体，依次加入倍比稀释的DH-TXB₂标准品（从125 μg/L开始稀释共8点）或待测血浆（直接测定）各50 μl，兔抗DH-TXB₂抗体和乙酰胆碱酯酶标记的DH-TXB₂各50 μl，在DH-TXB₂抗体量不足的情况下，酶标DH-TXB₂与标准品或待测血浆中DH-TXB₂竞争性与之结合，混匀置4℃过夜,洗涤5次后加入酶底物200 μl显色，用酶联免疫检测仪（λ＝410 μl）测定吸光度A值(曾称光密度OD值）。在半对数纸上绘制标准曲线，样品含量从曲线中查得。3.TXB₂的测定:用放射免疫法测定^［1］。4.CD 62P的测定:采用微量全血法。所有哮喘组与健康对照组血样共62份。（1）分别吸取100 μl 磷酸缓冲液PBS至2个12 mm×75 mm的塑料试管（1号为对照管，2号为测定管）中。（2）分别吸取2% EDTA（Na₂）抗凝全血5 μl加入至以上2个试管中。（3）1号管加入20 μl异硫氰酸荧光素（FITC）直接标记的小鼠IgG，2号管加入20 μl FITC直接标记的抗CD 62P单抗，轻轻混匀后室温下孵育25 min避光。（4）加入2 ml PBS液即上机（流式细胞计数仪）检测。CD62P的表达分别以阳性细胞百分比和平均荧光强度（MFI）表示。5.症状性哮喘患者中有17例及COPD 10例和正常对照者10名进行肺功能测定，分别测定FVC、FEV₁、FEV₁占预计值百分比及PEF。6.ECP的测定:应用Pharmacia CAP变应原检测系统(根据荧光免疫分析原理)测定血清ECP含量。该检测系统的灵敏度为2 μg/L。四、统计学处理实验结果以±s来表示，显著性差异用方差分析及q检验，治疗前后用配对t检验，相关分析用直线回归法。

　　结果一、症状性哮喘组、缓解哮喘组与健康对照组血小板活化指标的比较28例症状性哮喘血浆11-DH-TXB₂浓度在症状组与健康对照组间比较，差异有显著性（P＜0.01），症状组与缓解组间、缓解组与健康对照组间比较差异均有显著性(P均＜0.05)。TXB₂浓度在症状组与健康对照组间比较，差异有显著性(P＜0.05)。症状组与缓解组之间及缓解组与健康对照组间比较差异均无显著性（P＞0.05）。28例症状性哮喘患者血小板膜CD62P阳性百分比及平均荧光强度与缓解组和健康对照组比较，差异均有显著性（P分别＜0.01和＜0.05，表1）。二、10例哮喘患者治疗前、后的比较10例哮喘患者治疗前血浆11-DH-TXB₂水平显著高于治疗后，差异有显著性（P＜0.02），治疗前

表1　症状性、缓解期哮喘组与健康对照组血小板活化指标的比较（±s）

　　注：与健康对照组比较^△△P＜0.01，^△P＜0.05；与缓解期哮喘组比较^*P＜0.05

表2　10例哮喘患者治疗前、后比较（±s）

　　tXB₂水平高于治疗后（P＜0.05，表2）。三、症状性哮喘与COPD组和健康对照组血清ECP水平和肺功能的比较从症状性哮喘组随机选择17例同步测定血清ECP水平和肺功能，ECP水平在哮喘组（17±8）μg/L与COPD组（7±4）μg/L比较，差异有显著性（P＜0.05），与健康对照组（6±3）μg/L比较，差异有显著性（P＜0.05）;COPD组与健康对照组比较差异无显著性(P＞0.05)；哮喘组患者肺功能各指标与健康对照组比较差异均有显著性（P分别＜0.05和0.01）。四、哮喘发作时血小板活化指标及其与血清ECP的相关性血浆11-DH-TXB₂浓度与血小板膜CD 62P平均荧光强度值呈良好相关（r=0.701，P＜0.05），与气道炎症指标血清ECP水平呈显著相关（r=0.785，P＜0.05）。五、哮喘发作时血小板活化指标与肺功能的相关性血浆11-DH-TXB₂浓度与患者PEF显著负相关（r=-0.745，P＜0.05），与FEV₁占预计值百分比呈显著负相关（r=-0.867，P＜0.01）；CD 62P平均荧光强度值与PEF呈显著负相关（r=-0.822，P＜0.05）。讨论哮喘的发病涉及多种炎性细胞、细胞因子和炎性介质，由于它们之间错综复杂的网络关系，使哮喘的发病机制至今仍未完全明了，特别是关于血小板在其中的作用认识不多，研究结果也不完全一致。本组利用酶联免疫法及流式细胞仪分别测定哮喘患者血浆11-DH-TXB₂及血小板膜CD 62P的表达。血栓素TXA₂来自细胞的花生四烯酸代谢，其中绝大部分（80% 以上）均来自血小板^［2］；以往的研究多是通过测定血浆中TXB₂的含量来反映TXA₂的合成，但由于受到血小板体外活化的影响（如采集血样，实验操作等过程均可引起血小板活化），使测定值难以真实反映TXA₂的生成情况。据文献报道^［3］血小板体外活化产生TXB₂的能力远高于其体内生理浓度（约相差10³～10⁴倍），说明极少量的血小板体外活化即可非常显著影响其血浆浓度。而11-DH-TXB₂是TXB₂的体内酶代谢物，不受血小板体外活化的影响。本组试验结果表明，症状哮喘组、缓解哮喘组与健康对照组三者之间，其血浆11-DH-TXB₂的改变差异均有显著性。10例急性发作期患者经综合治疗后，随症状及肺功能的好转，11-DH-TXB₂和TXB₂虽明显降低，但TXB₂的改变仅在症状组与健康对照组间比较差异均有显著性，在症状组、缓解组以及缓解组与健康对照组间比较差异均无显著性。由此可见，通过测定11-DH-TXB₂来表示TXA₂的生成状况，从而反映血小板的体内活化更合理，更具优越性。TXA₂是强烈的血管和支气管平滑肌收缩因子，可引起微血管渗漏和粘液分泌，并促进平滑肌细胞增生和肥大，从而加重气道狭窄和气道阻塞，并可能在气道结构重塑中起作用。通过同步观察发现，哮喘发作期血浆11-DH-TXB₂与血清ECP及肺功能均呈良好的相关性，提示血小板有可能通过TXA₂等炎性介质的合成影响嗜酸细胞(EOS)功能来参与哮喘气道炎症的改变。耗竭豚鼠血小板后，TXA₂的释放及抗原诱发的支气管收缩反应均明显降低^［4］，不仅表明血小板是产生TXA₂的主要细胞，更强调其在哮喘反应中的重要性。Agrawal等^［5］的最近研究表明，TXA₂合成酶抑制剂DP-1904可明显减少PAF及IgG诱导的嗜酸细胞脱颗粒释放ECP，这种抑制效应与剂量有关，呈浓度依赖性。DP-1904浓度越高，抑制效应越明显。该研究结果与我们的试验似有不谋而合之处。故我们推测TXA₂是介导嗜酸细胞脱颗粒反应的重要炎性介质之一，TXA₂合成酶抑制剂用以治疗哮喘可能会提供有益的帮助。CD 62P（又称α颗粒膜蛋白）是血小板活化的特异性分子标志物。以往报道均通过放射免疫法测定血小板表面或血浆中可溶性分子数量，我们采用荧光素标记单抗及流式细胞计数仪来分析CD 62P阳性血小板的百分率或平均荧光强度值来反映血小板的活化程度，较之以往，由于极大的简化实验程序、时间，从而有效减少了血小板体外活化的影响。研究发现，哮喘发作时CD 62P阳性血小板百分比和平均荧光强度与健康对照组与哮喘缓解组比较差异有显著性，缓解组与健康对照组比较差异无显著性。此结果与Mortani等^［6］研究报道基本一致，在他们的试验中利用相似的方法测定血小板CD 62P平均荧光强度，发现哮喘组高于健康对照组但未达到差异有显著性，但当血小板在体外受刺激（与凝血酶或STA₂一同孵育）后则哮喘组的血小板CD 62P荧光强度值显著高于健康对照组。本组研究与其结果的少许差异在于他们的哮喘组成员均为稳定期患者，而我们的症状性哮喘均为急性发作期，故推测缓解期与健康对照组比较差异虽无显著性，但哮喘患者即使处于稳定缓解阶段，其体内血小板仍较为活跃或活化的阈值降低。同时也说明无论是CD 62P阳性血小板百分比还是平均荧光强度均可以良好的反映血小板活化，其活化水平与气道阻塞呈相关趋势，而CD 62P的表达似乎与激素的使用无明显相关。在本组资料中有2例慢性哮喘患者，临床上表现为激素依赖性，症状持续并反复加剧，即使加用激素后，其CD 62P阳性血小板百分比仍高达68%和60%，荧光强度分别是8.2和5.8，远高于其他患者，提示这类慢性重症哮喘体内血小板的过度活化可能与其气道炎症反应重而持久相关。因此对这些患者若联合应用抑制血小板活化的药物是否可以减轻炎症反应并减少激素用量将是一个非常值得探讨的问题。

　　参考文献1，王兆钺，何杨，阮长耿.¹²⁵I-血栓烷B₂放射免疫测定.苏州医学院学报，1986，6:13.2，Catella F,Fitzgerald GA.Paird analysis of urinaiy thromboxane B₂ metabolites in humans.Thromb Res,1987,47:647-656.3，Lawson JA,Patrono C,Ciabattoni G,et al.Long-lived enzymatic metabolites of thromboxane B₂ in the human circulation.Anal Biochem,1986,155:198-205.4，Takami M,Tsukada W.Correlative alteration of thromboxane A₂ with antigen-induced bronchoconstriction and the role of platelets as a source of TXA₂ synthesis in guinea pigs:effect of DP-1904,an inhibitor of thromboxane synthetase.Pharmacol Res,1998,38:133-139.5，Agrawal DK,Takami M,Ono S.A novel thromboxane synthetase inhibitor DP-1904 inhibits human blood eosinophil degranulation.Inflammation,1997,21:1-8.6，Mortani C,Ishioka S,Haruta Y,et al.Activation of platelets in bron chial asthma.Chest,1998,113:452-458.

(收稿日期：1999-11-11)