哮喘豚鼠血浆和肺组织鸟苷素的变化
中华结核和呼吸感染 2000年第7期第23卷 论著
作者：陈亚红 赵鸣武 庞宝森 王晓红 姚婉贞 唐朝枢
单位：陈亚红 赵鸣武 姚婉贞（100083 北京医科大学第三医院呼吸科）；庞宝森（北京市红十字朝阳医院）；王晓红 唐朝枢（北京医科大学第一医院心血管病研究所）
关键词： 哮喘；鸟苷素；气道炎症；气道分泌
【摘要】 目的 探讨鸟苷素在哮喘豚鼠发病中的变化。方法 16只豚鼠随机分为两组：对照组(6只)和哮喘组(10只)，采用放射免疫法测定血浆、支气管肺泡灌洗液(BALF)及肺组织鸟苷素，图像分析软件测定气道壁厚度及腺体厚度。结果 哮喘组动物血浆及肺组织鸟苷素分别较对照组增加56%及183%，差异有显著性(P＜0.01)。对照组BALF 鸟苷素4只低于检测水平，另2只分别为1.7 pg/ml及1.6 pg/ml，哮喘组BALF 鸟苷素为（3.1±1.2） pg/ml。肺组织鸟苷素水平分别与血浆鸟苷素水平及BALF鸟苷素水平呈正相关(r分别=0.72、0.61，P＜0.01、＜0.05)；血浆鸟苷素水平与BALF鸟苷素水平无明显相关(r=0.32，P＞0.05)。图像分析结果表明，哮喘组气道壁厚度及腺体厚度分别较对照组增加86%和87%，差异有显著性(P＜0.01)，肺组织鸟苷素水平与腺体厚度呈正相关(r=0.95，P＜0.01)。结论 鸟苷素可能参与哮喘豚鼠气道分泌增加的发病机制。
The changes of guanylin in plasma and lung tissue from asthmatic guinea pigs
CHEN Yahong, ZHAO Mingwu, PANG Baosen, et al.
（Respiratory Department, The Third School of Clinical Medicine, Beijing Medical University, Beijing 100083,China）
【Abstract】 Objective To study the changes of guanylin in asthmatic guinea pig models.Methods Male guinea pigs were randomly divided into two groups: the control （n=6) and the asthma group (n=10). The levels of guanylin in plasma, BALF and lung tissue were measured by RIA kit. The mean thickness of airway wall and glands was determined by contour tracing, using a digitizing pad and microcomputer.Results The levels of guanylin in plasma and lung tissue from the asthma group were 56% and 183% higher than those of the control (P＜0.01). Concentrations of guanylin in BALF from the control were below the detection level in 4 guinea pigs, and 1.7 pg/ml and 1.6 pg/ml in two，respectively. The level of guanylin in BALF from asthma group was （ 3.1±1.2）pg/ml. The level of guanylin in the lung tissue correlated with that in plasma and BALF (r=0.72，P＜0.01，r=0.61，P＜0.05, respectively). The level of guanylin in plasma did not correlate with those of BALF (r=0.32，P＞0.05). The mean thickness of airway wall and glands in asthma group were 86% and 87% greater than those of the control respectively (P＜0.01). The level of guanylin in lung tissue correlated with the thickness of glands (r=0.95，P＜0.01).Conclusions In the guinea pig model of asthma, guanylin in plasma , BALF and lung tissue were increased， indicating that it may play a role in the mechanism of airway hypersecretion in asthma.
【Key words】 Asthma； Guanylin； Airway inflammation； Airway secretion
哮喘是一种气道炎症性疾病，气道上皮受损，粘液分泌增加，纤毛清除功能降低，导致气道高分泌，加重气流阻塞。
然而，气道高分泌的机制尚未完全阐明。可能与嗜酸细胞中的颗粒蛋白(如主要碱性蛋白、嗜酸细胞阳离子蛋白等)引起的气道上皮损伤，气道上皮Cl和水分泌增加，粘膜上皮纤毛的清除功能受损等多种因素有关。
鸟苷素(guanylin)是肠上皮水、电解质调节的重要因子，参与分泌性腹泻［1］的发病。
近年研究发现［2,3］，肺组织Clara细胞可分泌鸟苷素，气道上皮富含鸟苷素受体，推测鸟苷素参与气道上皮分泌功能的调节。对此，我们在哮喘豚鼠模型上，观察血浆、支气管肺泡灌洗液(BALF)、肺组织鸟苷素的变化。
材料与方法
一、材料与试剂
豚鼠购自北京医科大学实验动物中心。卵蛋白为美国Sigma公司产品，鸟苷素测定采用美国Phoenix Phone公司放射免疫试剂盒。采用德国Leica Q550 IW 型图像分析仪进行图像分析。
表2 BALF细胞计数及分类(
±s)
| 组别 |
只数 |
回收率
(%) |
蛋白含量
(mg/ml) |
细胞计数
(×108/L) |
细胞分类 |
| 巨噬细胞 |
嗜酸细胞 |
中性粒细胞 |
淋巴细胞 |
| 对照组 |
6 |
76±6 |
0.3±0 |
9.3±2.2 |
0.74±0.05 |
0±0** |
0.020±0.010 |
0.24±0.05 |
| 哮喘组 |
10 |
73±6 |
0.6±0.3* |
18.9±6.6** |
0.68±0.04* |
0.09±0.02** |
0.020±0.010 |
0.21±0.02 |
注：与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01 二、豚鼠哮喘模型的建立
16只雄性豚鼠，体重300～400 g，随机分为两组。
哮喘组（10只）：腹腔注射10%卵蛋白生理盐水1 ml，14 d后每日给予1%卵蛋白生理盐水超声雾化吸入15 min诱发哮喘，共吸7 d。
对照组（6只）：除用生理盐水代替卵蛋白生理盐水外，其余操作与哮喘组相同。末次激发结束后18～24 h内取材作下述测定。
三、鸟苷素放射免疫测定［5］
1．标本的制备：豚鼠戊巴比妥钠（50 mg/kg腹腔注射）麻醉。腹主动脉取血加入10%乙二胺四乙酸10 μl/ml 和抑肽酶50 μl/ml，3 000 r/min离心10 min，取血浆-20℃保存备测。分离气管，行气管插管。
4℃生理盐水进行支气管肺泡灌洗，灌入总量每只5 ml。回收的BALF作计量后，取少量标本在高倍显微镜下细胞计数。将BALF离心（2 000 r/min）10 min，收集上清液，取1ml加入预冷乙酸(V∶V=10∶1)，煮沸10 min，置于-20℃保存备测。
离心沉淀细胞Wright-Giemsa染色，油镜下进行细胞分类。取部分右肺组织加入2 mmol/L预冷乙酸(m∶v=1∶5)煮沸10 min，匀浆后离心(4℃, 10 000 r/min) 10 min，取上清置于-20℃保存备测。
2．测定方法：按放射免疫试剂盒说明书进行。取待测标本过Seppak C18柱，采用双抗体分离法，测定结合的放射配基的放射强度，换算出相应的鸟苷素含量。
四、病理学检查
取右上肺组织置于10%福尔马林固定，作石蜡切片，行常规HE染色。采用图像分析软件测定不含软骨的完整气管横断面，测定参数包括内周长(Pi)、气道壁面积(Aw)、粘膜及粘膜下层面积(Ag)，以Aw/Pi表示气道壁厚度，Ag/Pi表示腺体厚度。
五、统计学处理
所有数据均以±s表示。采用t检验进行统计学检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
一、一般情况
在观察期间，激发后哮喘组动物精神差，毛发无光泽，活动减少，食欲差，体重较对照组减轻(P＜0.05)，见表1。
表1 各组动物体重变化比较(±s)
| 组别 |
鼠数 |
致敏前(g) |
激发前(g) |
激发后(g) |
| 对照组 |
6 |
333±27 |
343±23 |
348±19 |
| 哮喘组 |
10 |
337±30 |
350±25 |
318±28* |
注：与对照组比较*P＜0.05
二、BALF细胞计数及分类
两组BALF回收率均在70%以上。哮喘组BALF蛋白含量、细胞计数、嗜酸细胞分类均比对照组高，见表2。
三、血浆、BALF及肺组织鸟苷素含量
哮喘组血浆及肺组织鸟苷素水平分别较对照组增加56%及183%（P＜0.01），对照组BALF仅2只可测得鸟苷素，分别为1.7 pg/ml和1.6 pg/ml，其余均低于检测水平。
实验动物血浆鸟苷素水平与肺组织鸟苷素水平呈显著正相关(r=0.72，P＜0.01)；BALF鸟苷素水平与肺组织鸟苷素水平亦呈正相关(r=0.61，P＜0.05)；血浆鸟苷素水平与BALF鸟苷素水平无明显相关(r=0.32，P＞0.05)。见表3。
表3 血浆、BALF及肺组织鸟苷素含量(±s)
| 组别 |
鼠数 |
血浆(pg/ml) |
BALF(pg/ml) |
肺组织(pg/mg) |
| 对照组 |
6 |
45± 8 |
# |
2.8±0.6 |
| 哮喘组 |
10 |
70±10** |
3.1±1.2 |
7.9±2.2** |
注：与对照组比较**P＜0.01；#4只低于检测水平，另2只分别为1.7 pg/ml和1.6 pg/ml 四、病理学检查 光镜下，肺组织切片HE染色可见哮喘组气道粘膜、粘膜下组织大量嗜酸细胞浸润，气道壁增厚，粘膜及粘膜下层增厚，杯状细胞增生，形成许多空泡，气道腔有脱落的细胞及粘液。图像分析结果表明，哮喘组气道壁厚度及腺体厚度分别较对照组增加86%和87%(P＜0.01)。肺组织鸟苷素水平与腺体厚度呈正相关(r=0.95，P＜0.01)。见表4。
表4 肺组织气道壁厚度及腺体厚度(±s)
| 组别 |
鼠数 |
支气管数 |
气道壁
厚度（μm） |
腺体厚度
(μm） |
| 对照组 |
6 |
30 |
15.0±2.0 |
8.0±1.3 |
| 哮喘组 |
10 |
30 |
28.0±5.0* |
14.9±3.3* |
注：与对照组比较*P＜0.01
讨论
鸟苷素是一种由15个氨基酸组成的肽, 最早是从大鼠空肠提取物中分离发现的。它与大肠杆菌致病菌产生的热稳定肠毒素(STa)具有部分结构同源性，可引起分泌性腹泻。
鸟苷素是强大的内源性鸟苷酸环化酶激活物。鸟苷素与其受体鸟苷酸环化酶C(GC-C)结合，激活GC-C，使细胞内环磷酸鸟苷（cGMP）升高，激活囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)氯离子通道，在局部调节肠上皮水、电解质分泌［1］。
近年研究发现，肺组织亦可分泌鸟苷素。Cetin 等［2］发现牛、豚鼠及大鼠肺组织匀浆提取物中均存在鸟苷素，免疫组化研究发现，鸟苷素局限分布于远段传导气道内层无纤毛的分泌细胞(Clara 细胞)，表明Clara 细胞可能通过旁分泌作用在局部调节气道上皮的水、电解质平衡。
本组研究发现，哮喘组动物血浆、BALF、肺组织鸟苷素均较对照组显著升高，血浆、BALF鸟苷素水平均与肺组织鸟苷素呈正相关，推测哮喘动物血浆、BALF鸟苷素增高可能源于肺组织。
鸟苷素不仅在局部发挥旁分泌作用，同时释放入血，作为一种内分泌激素，影响肾水盐代谢。有文献报告［5］，肾脏参与鸟苷素的代谢，血浆鸟苷素水平在肾功能损害时升高，随血肌酐浓度升高而增加。哮喘时鸟苷素对肾功能的影响，本组未作观察。本组研究还发现，哮喘组肺组织病理切片可见气道壁增厚，粘膜及粘膜下层增厚，杯状细胞增生，形成许多空泡，气道腔有脱落的细胞及粘液。
图像分析结果表明哮喘组气道壁厚度及腺体厚度分别较对照组增加，其程度与肺组织鸟苷素变化一致，推测鸟苷素参与哮喘豚鼠气道分泌增加的发病机制。
鸟苷素可能引起气道高分泌的机制推测与细胞内cGMP增加有关。已知鸟苷酸环化酶(GC)分为可溶性GC及膜结合性GC，二者均能引起cGMP升高。气道上皮能够表达膜结合性GC-A、GC-B、GC-C，大肠杆菌热稳定肠毒素（STa）受体以及囊性纤维化跨膜电导调节剂（CFTR）氯离子通道。鸟苷素与其受体GC-C结合激活GC-C，使细胞内cGMP升高，激活气道上皮氯离子通道活性，从而对气道上皮的体液运输发挥重要的调节作用［3］。
哮喘动物血浆和肺组织鸟苷素表达增加的机制，目前尚不清楚。鸟苷素除作用于气道上皮，促进气道分泌外，Ohbayashi 等［4］还发现，鸟苷素可显著抑制卵白蛋白诱导的支气管收缩及微血管渗漏，其作用亦通过cGMP介导。鸟苷素在哮喘发病中的病理生理意义，值得进一步研究。
参考文献
1，Currie MG, Fok KF, Kato J, et al. Guanylin: an endogenous activator of intestinal guanylate cyclase. Proc Natl Acad Sci USA,1992，89:947-951.
2，Cetin Y, Kulaksiz H, Redecker P, et al. Bronchiolar nonciliated secretory (clara) cells:source of guanylin in the mammalian lung. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:5925-5929.
3，Zhang ZH, Jow F, Numann R, et al. The airway-epithelium:a novel site of action by guanylin. Biochem Biophys Res Communi,1998,244:50-56.
4，Ohbayashi H, Yamaki K, Suzuki R, et al. Effects of uroguanylin and guanylin against antigen-induced bronchoconstriction and airway microvascular leakage in sensitized guinea-pigs. Life Sci,1998,62:1833-1844.
5，Kuhn M, Kulaksiz H, Adermann K, et al. Radioimmunoassay for circulating human guanylin. FEBS Lett ， 1994, 341 : 218-222.
（收稿日期：1999-10-19）
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