牙周炎及胃病患者牙菌斑中的幽门螺杆菌

中华口腔医学杂志 1999年第1期第34卷 牙周病学研究

作者：胡文杰　曹采方　孟焕新　张集昌　马大龙　陈智滨

单位：胡文杰　曹采方　孟焕新　陈智滨（100081北京医科大学口腔医学院），张集昌（肿瘤学院），马大龙（分子免疫室）

关键词：螺杆菌，幽门；牙菌斑；胃病；牙周炎；聚合酶链反应

　　【摘要】　目的　明确牙周炎及胃病患者的牙菌斑中是否存在幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）及Hp是否为细胞毒素相关基因A（cytotoxin-associated gene A，cagA）阳性。方法　利用尿素酶C基因和cagA设计引物, 通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测口腔中的Hp。选择13例胃病及10例牙周炎患者，每例患者选6个有牙龈炎症的牙位取龈上、龈下菌斑，共计276份样本用于PCR检测。结果　胃病组11例患者和牙周炎组全部病例均至少有1份菌斑样本检出Hp，其中尿素酶C基因在胃病组的阳性率为28.8%（45/156），在牙周炎组为49.2%（59/120）；尿素酶C基因和cagA基因共同阳性率在胃病组为3.2%（5/156），在牙周炎组为3.3%（4/120）。取样部位Hp的检出与探诊深度及出血指数呈正相关。结论　口腔是Hp的一个聚集地。

Helicobacter pylori in dental plaque of periodontitis and gastric disease patients

HU Wenjie, CAO Caifang, MENG Huanxin，et al.

　　School of Stomatology, Beijing Medical University, Beijing 100081

　　【Abstract】　Objective　To investigate whether Helicobacter pylori(Hp) is a habitant in the oral cavity.Methods　A polymerase chain reaction (PCR) assay with oligonucleotide primers homologous to a portion of the urease C and cytotoxin-associated gene A (cag A) of Hp was used to test for the presence of Hp in dental plaque. This assay was able to detect the expected 294 bp and 400 bp DNA fragments from as few as 100 Hp cells per reaction. Thirteen gastric disease patients (Group G) and 10 periodontitis patients (Group P) were recruited. A total of 276 supra- and subgingival plaque samples were collected, from 6 teeth in each subject for PCR assay. Clinical periodontal parameters including probing depth (PD), bleeding index (BI) and plaque index (PLI) of the sampled sites were recorded.Results　In Group G, 11 of 13 patients had at least one Hp-positive plaque sample. 28.8% of the tested samples were urease C gene positive and 3.2% were positive for both urease C and cag A genes. All the 10 patients in Group P had at least one Hp-positive plaque sample. 49.2% of the tested samples were urease C gene positive and 3.3% were positive for both of the Hp genes. The prevalence of Hp was positively correlated with probing depth and bleeding index at the sampled sites.Conclusion　These results suggest that oral cavity is an ecological niche of Hp.

　　【Key words】　Helicobacter pylori 　　 Dental plaque 　　 Stomach disease 　　 Periodontitis 　　Polymerase chain reaction

　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是一种营养要求高，微需氧的革兰阴性细菌^［1］。研究表明Hp是慢性活动性胃炎和胃十二指肠溃疡的主要病因，是胃癌发生的高危因子。但有关Hp的传播途径及传染源等尚未明了^［2］。1989年Krajden等^［3］从口腔中首次分离出Hp，此后多种方法应用于口腔中Hp的研究，但报道结果迥异。本研究依据Hp尿素酶C基因^［4］和细胞毒素相关基因(cytotoxin-associated gene A，cagA)^［5］设计引物，通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测取自多个牙位龈上、龈下菌斑中的Hp，旨在明确Hp是否存在于胃病及牙周炎患者的牙菌斑中、是否为cagA基因阳性的Hp菌株。

　　材料和方法

　　1.病例选择： 胃病组：主诉有上消化道症状、经北京医科大学肿瘤学院内镜室检查确诊为各种胃炎的胃病患者13例，男8例，女5例，年龄34～52岁，平均42岁，口腔检查均有牙龈炎或轻度牙周炎。牙周炎组：10例患者均选自北京医科大学口腔医学院牙周科门诊，均主诉无消化道症状，其中男5例，女5例，年龄26～52岁，平均40.7岁。两组患者均符合以下要求：①无其他系统性疾病；②3个月内未服用过抗生素及胃药；③12个月内未接受过牙周治疗；④全口牙不少于24颗。

　　2.取样和检查：从每例患者口腔内选择有牙龈炎症的6颗牙作为取样牙。以棉球隔湿，吹干后分别用消毒刮匙刮取龈上、龈下菌斑，即刻检查并记录牙周临床指数：菌斑指数(plaque index，PLI)、探诊深度(probing depth，PD)及出血指数(bleeding index，BI)。

　　3.提取DNA：按PCR试剂盒的要求快速提取菌斑样本中的DNA，将菌斑悬浮于100 μl样本处理液(BIO-RAD Co)中，56℃孵育30 min，高速震荡10 s后置100℃水浴8 min，再次高速震荡10 s，离心(12 000 r/min, 4 ℃)3 min。取上清用于PCR扩增。

　　4.PCR检测Hp: PCR试剂盒(Pacific Econ-Tech Co.U.S.A.）内含两对引物，预期扩增片段为294bp及400bp。20 μl反应体系含有两对引物各20 pmol/L，每种寡核苷酸4 mmol/L，DNA模板4μl，Taq DNA聚合酶2U及PCR缓冲液。反应在^TMRobocycle gradient 40 型扩增仪（Stratagene公司）上进行。94 ℃预变性5 min，以94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min为1个循环，共计35个循环，最后1次循环72℃继续延伸7 min。以Hp标准株NCTC 11637(中国预防医学科学院陈晶晶教授惠赠)和1株Hp临床分离株（北京医科大学肿瘤学院）的DNA提取液分别作为阳性对照，采用PCR试剂盒内的阴性对照。用8％丙烯酰胺电泳鉴定PCR产物。为减少污染机会，DNA提取、PCR扩增及电泳分析分别在3个房间进行。

　　5.PCR敏感性和特异性试验：Hp纯培养72 小时，刮取菌落以生理盐水稀释，镜下计数测得菌液浓度。用样本处理液10倍系列稀释后使菌液每4μl含1、10、10²、10³、10⁴及10⁵个细菌，提取DNA用于PCR扩增。另外，提取牙龈卟啉菌、直弯曲菌、唾液链球菌、解脲类杆菌及大肠杆菌（均为国际标准株）的DNA，与被测样本同时进行PCR扩增。

　　结果

　　1.PCR方法的敏感性和特异性：本实验所用的PCR方法最少能检测到100个Hp细菌。扩增的上述5种其他细菌均为阴性，说明本方法敏感性和特异性较好。

　　2.牙周临床检查结果：胃病组的PD及BI均小于牙周炎组，胃病组分别为(2.76±0.98)mm及2.69±0.78，牙周炎组分别为 （5.74±1.42）mm及3.12±1.09，两组间比较P＜0.01，差异有极显著性。两组患者的PLI相近，胃病组为2.62±0.69, 牙周炎组为2.15±0.76，两组间比较P＞0.05，差异无显著性。

　　3.菌斑中的Hp检测：胃病组和牙周炎组菌斑中Hp的PCR检查结果见表1。胃病组中的11例及牙周炎组的全部患者均至少有1份菌斑样本中检出Hp，其中胃病组尿素酶C基因阳性率为28.8％（45/156），尿素酶C基因和cagA基因共同阳性率为3.2％（5/156），牙周炎组尿素酶C基因阳性率为49.2%（59/120），两种基因的共同阳性率为3.3％（4/120）。表2结果显示，龈下菌斑中Hp的检出率显著高于龈上菌斑(P＜0.01)。

　　4.Hp与牙周临床指标的相关关系：用Kendall-test分析Hp检出率与牙周临床指数的相关关系。在PD≥4mm的位点，菌斑中Hp检出率高于PD＜4mm的位点(P＜0.01)；而PD在4～5 mm处与大于6 mm处的龈下菌斑中，Hp检出率无明显差异(P＞0.05)。Hp的检出率与取样部位的BI明显相关(P＜0.05)。

表1　两组患者牙菌斑中幽门螺杆菌的PCR检测结果

　　注：PCR：聚合酶链反应；U(+)：尿素酶C基因阳性；U+C(+)：尿素酶C基因及cag a基因均阳性

表2　Hp在龈上和龈下菌斑中的分布

　　注：Hp：幽门螺杆菌；U(+)：尿素酶C基因阳性；U+C(+）：尿素酶C基因及cag a基因均阳性；* 龈下菌斑显著高于龈上菌斑， p＜0.01讨论

　　口腔菌斑复杂、特殊的生态环境及Hp复杂的营养要求，使得从菌斑中培养分离Hp较为困

　　难^[6]。近年来高敏感、高特异性的PCR技术已成功地用于检测菌斑和唾液中的Hp^［7］。然而许多研究即便运用PCR方法也未能从菌斑中检测出Hp^［8］。这些研究结果的不同，原因之一是菌斑取样部位及方法的差异,许多研究对龈上菌斑和龈下菌斑不加区别，没有考虑牙位特异性，而不同取样方法（纸捻法、牙签法、刮匙法）获取的菌斑成分的质和量差异甚大。原因之二可能与采用的DNA提取方法及PCR引物设计不同有关。基于Hp的不同特异基因如尿素酶基因，16SrRNA，特异26 000蛋白的编码基因和随意选择的DNA片段的引物设计建立了多种PCR方法，从菌斑中获取和纯化Hp DNA的不同方法可以造成最终DNA模板质和量的差异，直接影响了PCR检测的结果^[6]。本研究中，我们从每例患者口腔中取6个牙位的龈上、龈下菌斑共12份样本，多份样本的分别检测减少了假阴性率；以快速提取法获取菌斑样本中的DNA，损失量较小；本研究选用美国市售PCR试剂盒，扩增的两段目的基因(urease C 基因：294bp, cagA基因：400bp)，其特异性已由Bickley等^[4]及Lage等^［5］通过杂交和酶切得到证实；本实验有约3%的标本为两个基因片段均阳性，而阴性对照组所用的一些可能产生尿素酶的细菌却未能扩增出，综上分析，本组结果的可信性较高。另外从本研究的两组患者血清和龈沟液中检测出抗 Hp的IgG抗体（将在另文报道），也是有力佐证。本研究中胃病患者的牙菌斑中Hp检出率为28.8％(尿素酶C基因阳性)，与Mapstone等^[7]报道用巢式PCR检测的结果（23.8%）相近。

　　以往对非胃病人群菌斑内Hp的研究仅有少量报道，Majmudar等^[9]从健康人菌斑中培养分离出Hp(100％)，而Asikainen等^[8]用PCR法检测336例牙周炎患者的1 000份菌斑，均未检出Hp。本研究从无主诉消化道症状的牙周炎患者的菌斑中也检出Hp(49.2%)。值得一提的是，来自不同研究结果的差异除上面分析的原因外，Hp感染还可能与种族、饮食、教育、经济状况等的差异有关^[10]。

　　我们还首次初步分析了菌斑中Hp的存在与牙周袋的深度及炎症状况的关系。结果提示从受检者的多个存在炎症、中等深度的牙周袋处取样有可能提高Hp的检出率。我们的研究结果支持菌斑是Hp的另一个生存环境的假说。尽管如此，口腔内Hp究竟从何而来、在牙周病的发生和发展中起何作用及其与胃内Hp感染的关系等，尚需进一步研究。

　　参考文献

　　[1]　Warren JR, Marshall BI. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet, 1983, 1: 1273.

　　[2]　Tursi A, Cammarota G, Papa A, et al. The modes of transmission of Helicobacter pylori infection. Recent Prog Med，1997， 88: 232-236.

　　[3]　Krajden S, Fuksa M, Anderson J， et al. Examination of human stomach biopsies, saliva， and dental plaque for Campylobacter pylori. J Clin Microbiol, 1989, 27:1397.

　　[4]　Bickley J, Owen RJ, Fraser AG, et al. Evaluation of the polymerase chain reaction for detecting the urease C gene of Helicobacter pylori in gastric biopsy samples and dental plaque. J Med Microbiol, 1993, 39：338-344.

　　[5]　Lage AP, Godfroid E, Fauconnier A ，et al. Diagnosis of Helicobacter pylori infection by PCR: comparison with other invasive techniques and detection of cagA gene in gastric biopsy specimens. J Clin Microbiol, 1995, 33: 2752-2756.

　　[6]　Nguyen AM, Zaatari FA, Graham DY, et al. Helicobacter pylori in the oral cavity: a critical review of the literature. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod， 1995，79:705-709.

　　[7]　Mapstone NP, Lynch DA, Lewis FA, et al. Identification of Helicobacter pylori DNA in the mouths and stomachs of patients with gastritis using PCR. J Clin Pathol ，1993， 46:540.

　　[8]　Asikainen S, Chen C, Slots J. Absence of Helicobacter pylori in subgingival samples determined by polymerase chain reaction. Oral Microbiol Immunol, 1994, 9:318-320.

　　[9]　Majmudar P, Shah SM, Dhunjibhoy KR, et al. Isolation of Helicobacter pylori from dental plaques in healthy volunteers. Indian J Gastrienterol, 1990, 9:271-272.

　　[10]　Madinier IM, Fosse TM, Monteil RA, et al. Oral carriage of Helicobacter pylori: a review. J Periodontol，1997:68:2-6.

（收稿：1998-05-26　　修回：1998-09-01）