胃肠道平滑肌肿瘤Ki-67的检测及其临床病理意义

　　中国医科大学学报2000年第29卷第1期

孙威　王宇令　王强　王明德　秦晔　张凤祥　于文泉

　　摘　要　目的：探讨人抗增殖细胞核抗原Ki-67表达与胃肠道平滑肌肿瘤(gastrointestinal smooth muscle tumors, GISMT)良恶性、恶性程度、转移及预后的关系。方法：采用微波修复抗原及免疫组织化学S-P法检测86例GISMT中Ki-67的表达情况。结果：Ki-67表达按平滑肌瘤，平滑肌肉瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级的顺序依次明显上升(P＜0.01)。Ki-67的表达与肿瘤的良恶性生长方式、大小、中心有无坏死亦有明显的关系(P＜0.01)。Ki-67低表达组的5年生存率(87.5%)明显高于高表达组(32.3%)(P＜0.05)。结论：Ki-67是反映GISMT生物学特性的良好标志物，可以作为判断GISMT良恶性、恶性程度、转移及预后的客观指标。

　　关键词：胃肠肿瘤　平滑肌瘤　平滑肌肉瘤　人抗增殖细胞核抗原Ki-67

　　胃肠道平滑肌肿瘤(gastrointestinal smooth muscle tumors, GISMT)较少见，临床变异较大，病理形态复杂多样，加之其间质内血管丰富，转移潜能较大，因此，给临床诊断、预后判断造成很大困难。本研究应用免疫组织化学S-P法检测GISMT中Ki-67表达，结合临床病理及预后进行综合分析，探讨其在鉴别GISMT良恶性、恶性程度及判断预后方面的意义。

　　1　材料与方法

　　1.1　临床病理资料

　　本研究选择我院1977年～1996年4月间手术切除的GISMT病例中诊断明确、病历完整者86例，男49例，女37例，年龄1～77岁。肿瘤发生于食管11例，胃30例，小肠27例，结直肠18例。根据镜下观察，选择细胞生长活跃区连续计数30个高倍视野(HPF)，确定每10个HPF中平均核分裂数。按Evans^［2］和He lJ等^［3］的标准区分平滑肌瘤(leiomyoma, LM)、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma, lS)。LS组织学分级参考Patrick等^［4］的标准。其中LM 25例；LSⅠ级(LSⅠ)26例，Ⅱ级(LS Ⅱ)20例，Ⅲ级(LSⅢ)15例。根据大体病理特征分为：恶性生长方式组(肿瘤有周围浸润、种植或转移)40 例；良性生长方式组(肿瘤无周围浸润、种植或转移) 46例。肿瘤直径为0.3～5.9 cm组 38 例；6～10 cm组 25 例；＞10 cm组23 例。肿瘤中心有坏死组 41 例；无坏死组 45 例。另取 8例正常胃肠道平滑肌组织(NSMT)作为对照。本组 86 例GISMT中，除3例因其它原因死亡外，其余83 例随访资料完整，随访时间为 12～242 个月，平均 58 个月。

　　所有标本均经 10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规连续切片，分别做HE染色，Ki-67微波修复抗原与免疫组织化学染色。

　　1.2　试剂

　　鼠抗人Ki-67(MIB-1)单抗工作浓度为1∶100，S-P试剂盒工作浓度为1∶150，均购自福州迈新生物制品公司。

　　1.3　实验方法

　　1.3.1　微波修复抗原方法：

　　(1)组织经脱蜡后用 3% H₂O₂或 0.5%的过碘酸处理50 min。(2)蒸馏水冲洗3 min×2次。(3)将预先涂有聚L赖氨酸的组织切片经上述处理后完全浸泡于盛有0.01 mol/L柠檬酸缓冲液 pH＝6的玻璃载玻片缸中，盖上盖子(不要盖密)，放于微波炉内于解冻或“defrost”档加热7～10 min，(加热过程中若遇缸中水量减少，可加蒸馏水至原先量即可)。(4)取出玻璃载玻片冷却至室温。(5)PBS溶液(pH＝7.2)冲洗3 min×3次。

　　1.3.2　免疫组织化学染色S-P法。

　　1.3.3　结果判定：以细胞核呈棕红色或细胞核，细胞浆同时呈棕红色为阳性；单纯细胞浆着色而细胞核无着色，或细胞核，细胞浆均无着色为阴性，于40倍光镜下10个视野计数，每个视野计数100个细胞，Ki-67标记值为：(阳性细胞总和／1000)×100%，同已知阳性片对照。

　　1.4　数据处理

　　t检验。患者生存率分析采用Kaplan-Meier寿命法及Log-rank检验。

　　2　结果

　　随着GISMT良恶性改变及恶性程度的增高，Ki-67标记值依次明显递增(P＜0.01)。另外，Ki-67与肿瘤良恶性生长方式、肿瘤大小、肿瘤中心有无坏死，亦有明显关系(P＜0.01)见表1。

表1　Ki-67与GISMT临床病理特征的关系(X±s)

　　Table 1　The relationship of the expression of Ki-67 with

　　the clinical and pathologic features of GISMT

　　Ki-67低表达组(＜均数5.25)5 年生存率为 87.25%，高表达组(≥均数5.25)5年生存率为32.30%。两组间存在显著差异(P＜0.05)。

　　3　讨论

　　Ki-67是由Gerdes等^［4］于1983年首次制备成功，它存在于增殖细胞当中，在静止细胞则不表达。Ki-67的免疫染色揭示细胞核的反应性存在于卵泡细胞皮质的胚胎中心、胸腺细胞的皮质、胃肠道粘膜的上皮细胞、未分化的精原细胞及很多的人类细胞株。Ki-67抗体不与处于静止期的细胞发生反应，如淋巴细胞、单核细胞、胃肠道粘膜的壁细胞等。Ki-67能直接与反映肿瘤增殖的核抗原发生反应，从而用于肿瘤组织活检。

　　随着研究的深入，Gerdes等^［5］提出：Ki-67是针对处于增殖周期的人类细胞核抗原的抗体，能标记G₁后期、S期、G₂期和M期细胞核，G₁早期和G₀期细胞核不被标记。Gerdes^［6］于1985年进一步提出将Ki-67应用于外科手术中的快速病理诊断，提示Ki-67具有判断预后和有助于治疗方案的选择，为 ki-67广泛应用尤其是快速病理诊断提供了理论基础。微波修复抗原方法的出现^［7］，使 ki-67 的应用范围明显扩大。

　　本文结果表明：从LM到LSⅠ、Ⅱ、Ⅲ级，其Ki-67表达逐渐升高，说明肿瘤的分化程度越低，增殖活性越强，恶性程度越高，基本反映了肿瘤细胞增殖和分化程度的一般规律。目前认为GISMT的体积大小、周围是否有侵袭、中心有无坏死均是临床病理判断GISMT良恶性的重要依据。本研究提示：肿瘤体积大、中心有坏死、生长方式有临近器官的浸润或腹腔种植和远处转移时，Ki-67计数均明显提高。本研究结果也提示：Ki-67高表达组与低表达组的5年生存率之间存在显著性差异，但它是否能成为一个GISMT的独立预后指标，还有待进一步扩大样本，长时间的大量随访及与其它因素的对比统计分析才能确定。因此可以认为Ki-67是判断GISMT恶生程度、肿瘤分类分级及预后较好的一种指标。

　　辽宁省自然科学基金资助项目，972254秦晔（辽宁中医学院普外科)

　　张凤祥（西丰县第一人民医院外科)

　　于文泉（北票矿务局医院普外科)

　　孙威（中国医科大学第二临床学院外科，沈阳110003）　王宇令（中国医科大学第二临床学院外科，沈阳 110003）　王强（中国医科大学第二临床学院外科，沈阳 110003）　王明德（中国医科大学第二临床学院外科，沈阳 110003）　秦晔（中国医科大学第二临床学院外科，沈阳 110003）　张凤祥（中国医科大学第二临床学院外科，沈阳 110003）　于文泉（中国医科大学第二临床学院外科，沈阳 110003）

　　参考文献

　　1，Evans HL. Smooth muscle tumors of the gastrointestinal tract: a study of 56 cases followed for a minimum of 10 years. Cancer, 1985, 56(9): 2242-2250

　　2，He LJ, Wang BS, Chen CC. Smooth muscle tumors of the digestive tract: report of 160 cases. Br J Surg, 1988, 75(2): 184-186

　　3，Patrick CM, James PN, Walter L, et al. Gastrointestinal Sarcomas: analysis of prognostic factors. Ann Surg, 1987, 2060(6):706-710

　　4，Gerdes J, Schwab U, Lemke H, et al. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associate with cell proliferation.Int J Cancer, 1983, 31(1): 13-20

　　5，Gerdes J, Lemke H, Baisch H, et al. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol, 1984,133(4): 1710-1715

　　6，Gerdes J. An immunohistological method for estimating cell growth fractions in rapid histopathological diagnosis during surgery. Int J Cancer, 1985, 35(2):169-171

　　7，Shi SR, Key ME, Kalra KL. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based no microwave oven heating of tissue sections. J Histoche Cytoche,1991, 39(6): 741-748