幽门螺杆菌感染动物模型的实验研究

　　国外医学消化系疾病分册1999年第19卷第4期

上海医科大学附属华山医院消化科（200040）　范钰（综述）　林庚金（审校）

　　摘要　幽门螺杆菌感染动物模型的实验研究是目前研究热点之一。一个成功的幽门螺杆菌感染动物模型，有利于幽门螺杆菌疫苗的研制。本文对幽门螺杆菌感染模型所用细菌、动物以及动物模型的病理改变等方面的研究进展作一综述。

　　关健词：幽门螺杆菌　动物　模型

　　幽门螺杆菌（Hp）感染是世界范围的疾病，尽管有许多短程三联或四联疗法能达到90%以上的根除率^[1]，但是广泛应用或滥用药物会导致耐药菌在人群中传播，有些疗法不良反应太大，病人不易耐受。要在全世界范围完全根除Hp，唯一可行的方案是免疫接种。如能研制出合适的疫苗，就能象消灭天花病毒那样根除Hp。开发Hp疫苗的关健就是研制出一个理想的Hp感染动物模型。近年来，许多学者在研制Hp感染动物模型的实验研究方面作了大量的工作，取得了一定的成绩。

　　1　模型所用细菌

　　在动物胃肠内存在着很多种类的螺杆菌，Hp仅是螺杆菌家族中的一个代表。该家族的共同特征为：（1）多形性：螺旋形、弧形、或近似杆状；（2）鞭毛；（3）微需氧生长；（4）能产生尿素酶、过氧化氢酶、氧化酶、磷脂酶、脂酶、空泡毒素、粘附因子等；（5）16sRNA序列，菌体脂肪酸组成有及菌体蛋白SDS-PAGE电泳有高度同源性。已经研制的模型所用细菌多采用人或动物胃肠内分离所得的螺杆菌。目前，已成功地从不同的动物中分离出不下16种螺杆菌，如从人胃中分离的H.pylori；从猫和狗胃中分离出的H.felis(Hf)；从雪貂胃中分离出的H.mustelae(Hm)；从猎豹胃中分离出的H.acinonyx；从猪胃中分离出的H.suis等。大多数学者采用从人或两种动物胃内分离的螺杆菌研制模型。Dubois^[2]、Marchettii^[3]、Radin^[4]、Karita^[5]、Karakowka^[6]、Tatematsu^[7]、Lee^[8]等采用从人胃分离的Hp，成功建立了Hp感染动物模型：Enno^[9]、Glauser^[10]、Fox^[11]等采用Hf（猫螺杆菌）建立了动物模型；Fox^[12]采Hm(鼬鼠螺杆菌)在雪貂上建立了Hp感染动物模型；有人采用H.heimannii（海曼螺杆菌）研制模型。研究显示，不同的螺杆菌群集繁殖能力不同，致病作用有强弱之分，即使是同一种类的螺杆菌也可因其不同菌株而使感染程度有明显的差异。另外，长期在体外传代的实验菌株与从人及动物胃新鲜分离的临床菌株，在胃粘膜群集繁殖的能力也不同。为了使不同研究者的研究结果具有可比性，1995，从事疫苗研究的学者在瑞士洛桑开会，建议对制出Hp感染的动物模型确定一个——“洛桑标准”。该标准包括：任何使用Hp-小鼠模型的研究应该提示以下几个方面的资料：（1）HP在胃窦和胃体及贲门的分布及感染程度；（2）采用尿素酶方法测定群集繁殖时达到阳性所需时间；（3）每克胃粘膜HP繁殖的数目；（4）是否出现粘附现象；（5）群集繁殖的最长时间；（6）组织病理学改变；（7）从动物模型中分离的HP经体外多次接种仍保持它的群集繁殖能力。澳大利亚学者以澳洲分离的达到上述标准的HP菌株Sydney株作为疫苗研究的标准菌株。

　　2　模型所用动物

　　HP是一种人胃壁的寄生菌，一般它并不容易在任何动物中群集繁殖。自从1982年澳大利亚学者首先从胃中分离出HP后，国内外许多学者试图用常规实验动物（包括小鼠、大鼠、豚鼠、家兔等）口服攻击法建立HP感染动物模型，结果均未成功。Karakowka[6]考虑到猪是杂食性动物，猪胃解剖结构和生理机能与人胃相似，于是用GF级（Germ-Free，无菌）小猪口服接种HP，成功地建立了HP感染悉生猪模型。1990年，Radin^[4]用SPF级（Specific-pathogen-free，无特定病原体）的小猎狗建立了HP感染悉生狗模型。也有人用猫建立了HP感染动物模型^[13]。猪、狗、猫等这些较大动物病理生理同人类接近，但采用这些动物制作HP感染模型的研究并不能广泛推广。因而近年来较多学者采用小动物进行HP感染模型的研究。Lee^[8]采用GF级的SW小鼠口服接种Hf，第一次成功地在小动物上建立了猫螺杆菌一小鼠模型。1991年，Karita^[5]采用BALB/c裸鼠，经口服接种HP以建立动物模型，获得成功。蒙古鼠（Mongdian gerbils）是一种啮齿类动物，自人体分离的HP菌株很容易在其胃粘膜群集繁殖并引起相关性胃炎。Hirayama^[14]、Matsumoto^[15]、Tatematsu^[7]均在蒙古鼠上建立了HP感染模型，但病变的严重程度并不一致。这一模型的建立在研究HP的致病机理及疫苗研制方面的一定价值，以上几种不同的小型动物模型的研制虽获成功，但是迄今仍然未被普遍认可。用GF级或SPF级动物制备动物模型，需要的昂贵的设备条件、复杂的饲养管理和操作技术。裸鼠饲养虽比GF级、SPF级动物容易，但有免疫缺陷，不能很好地模拟人体免疫状态，实验观察也不方便，所以，这些动物模型仅能解决某些特定条件下的问题，仍不是完美无缺的。雪貂是一种产于北美、北欧与南太平洋地区的动物，其胃解剖生理物特征与人类相似。近年来，一些学者^[11]用寻貂研究了HP感染动物模型。与人类一样，雪貂也是在幼年（即断奶后）获得螺杆菌自然感染，而且几乎100%的成年雪貂感染了Hm。雪貂的Hm自然感染使Hp模型研制出现了难度。近年最重要的进展是已经繁衍出一群无Hm感染的实验性雪貂。采用抗螺杆菌疗法治疗，从雪貂怀孕时到幼仔出生为止，此后HP阴性者一直保持无螺杆菌状况^[16]。雪貂模型主要优点在于其为唯一的螺杆菌自然感染模型，但该模型未表现出炎症的活动性成分，即多形核细胞。灵长类动物显然是研究螺杆菌感染的理想对象。已经有人用灵长类动物（如猴）研制Hp感染动物模型。Fujioka^[17]用氨苄青霉素治疗13只日本猴以根除自然感染的海曼螺杆菌，然后用从人胃分离的HP菌株接种其中6只。结果，经培养及组织学检测，这6只猴均获得HP持续性感染，胃炎也较对照组严重，且病理改变与人体慢性活动性胃炎相似。灵长类动物模型未能广泛应用，原因在于这类动物来源的较困难。

　　3　模型的病理改变

　　1994年，美国国立卫生研究院和世界卫生组织癌症研究中心分别宣布Hp为胃炎、消化性溃疡的病因，也是胃癌第一类致癌因子。此外，HP感染也与非溃疡性消化不良及儿童某些胃肠疾病有关。现在已建立了Hp感染动物模型为此提供了大量的依据。在不同的动物模型上，都已经复制出Hp相关性胃炎、Hp相关性溃疡病、Hp相关性癌变，而且能够显示出各种动物模型的病理特征与人类很类似。但是，由于选用了不同的细菌和不同的动物研制模型，所以其病理改变出现的时间不同，病变程度有差异，病理特征也不完全一致。

　　3．1螺杆菌相关性胃炎

　　各模型均出现HP相关性胃炎表现。在病理改变早期，均可见到散在淋巴细胞、浆细胞和嗜酸性粒细胞浸润，主要位于腺下区域，随着感染时间的延长，细胞浸润的范围扩大、程度加重，且有中性粒细胞浸润，可穿过固有层向腺腔扩散。在感染的后期，可见淋巴滤泡形成，并出现萎缩性胃炎的病理改变。在所研制的螺杆菌动物相关性胃炎模型中，一般可出现嗜酸性粒细胞。这可以说是一个特征性病理改变，因为正常人和动物通常无嗜酸性粒细胞浸润，但是在螺杆菌自然感染的动物胃粘膜常可见到这种细胞。

　　至于病理改变出现的时间，各研究结果不完全一致，这可能与接种螺杆菌的致病强度与数量有关。大多数模型在口服接种螺杆菌2周左右，即可见到散在淋巴细胞浸润，6周左右浸润细胞增多，可见到嗜酸性粒细胞，随后出现进行性的病理改变。萎缩性胃炎出现较晚。细菌群集繁殖范围较广，一般可出现于动物胃内的各个区域，包括胃窦、胃体、胃角。Danon^[18]发现，螺杆菌自然定植的动物，螺杆菌在胃窦和胃体定植机会相当，而定植密度与腺体的壁细胞数目相关，局部的胃酸分泌决定了螺杆菌在胃内的分布。

　　3．2螺杆菌相关性溃疡^[17，19]

　　螺杆菌感染动物模型见到溃疡的报道相对较少，且溃疡的病理改变出现时间较晚。Matsumoto^[15]给SPF级的蒙古鼠口服Hp，感染4周后进行组织学检查，发现所有动物的胃都有严重炎症，多形核淋巴细胞和单核细胞浸润于蒙古鼠胃窦的粘膜下层及粘膜固有层。8周后，胃窦部粘膜及粘膜固有层出现多中心淋巴滤泡，上皮层也可见到微小糜烂。16周后，在胃窦部出现粘膜肌层断裂、溃疡。溃疡在动物模型上很少出现，一方面可能与宿主反应和不同菌株致病力存在差异有关，另一方面也是提示，Hp与溃疡的关系比HP与胃炎的关系更复杂。

　　3．3螺杆菌感染与胃癌发生的相关性

　　临床资料表明，Hp感染与胃癌发生具有一定的关系。Tatematsu^[7]用MNNG（N-亚基-N-亚硝基胍）、MNU（甲基亚硝脲）作为致癌物建立了胃癌的蒙古鼠动物模型。在口服Hp之后，喂以MNNG和MNU。20周后发现，一些蒙古鼠出现了分析程度不同的胃腺癌。服Hp组腺出现率高于未口服Hp组。Sugiyama^[20]将170只雄性蒙古鼠成分9组，其中4组在喂MNU之前预先接种Hp，在只喂MNU组或单独喂Hp组都未见到肿瘤。这两种模型表明，Hp并非胃癌的特异病因，而只是许多致病因素中的一个。Hp与其它因素结合在一起，增加了致癌因素诱发动物胃癌的机率。

　　Enno^[9]在自己研制的Hf感染BALB/c小鼠模型上用免疫组化染色发现浸润的淋巴细胞主要是B细胞，与人类MALT的细胞组成相同，提示螺杆菌可引起动物胃粘膜MALT。

　　4　结语

　　总之，在全球范围内进行Hp疫苗接种，是经济有效、值得优先发展的重大课题。Hp感染动物模型的实验研究将为疫苗的可行性研究提供有价值的依据。已经制备的Hp感染动物模型，都存在一些问题，例如动物来源、Hp菌株接种量以及长期感染等。因此，探讨和研制一个经济、简便、易复制、更好地模拟Hp在人类致病情况并能得到多数学者一致认可的Hp感染动物模型，仍然是一个重要的课题。

　　参考文献

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