幽门螺杆菌亚型cagA^＋基因株与胃癌的关系

　　军医进修学院学报2000年第21卷第1期

王思平　吕俊旭　王孟微

　　摘　要：目的：探讨幽门螺杆菌(Hp)细胞毒素相关基因A阳性株(cagA^＋株)与胃癌的关系。方法：通过多聚酶链反应(PCR)检测92例胃癌和24例浅表胃炎组织石腊标本Hp和cagA^＋亚型株的感染。结果：①Hp感染在胃癌和慢性浅表胃炎间无差异，而cagA^＋株感染是前者高于后者(P＜0.05)；②Hp感染早期胃癌高于进展期癌、胃窦癌高于贲门癌、肠型胃癌高于弥漫型癌(P＜0.05)。然而只有肠型胃癌cagA^＋株感染显著高于弥漫型癌(P＝0.00135)。结论：胃癌不同组织类型感染Hp亚型的程度不同，Hp-cagA^＋株感染率在肠型胃癌中显著增高。从而推测产生细胞毒素的Hp菌株，可能是胃癌尤其是肠型胃癌的发生发展过程中重要的危险因素。

　　关键词：幽门螺杆菌；细胞毒素相关基因A；胃癌

　　大量的流行病研究证实幽门螺杆菌(Hp)与胃癌的关系密切相关。但是Hp的致癌机制还不清楚。随着近年来对Hp研究的深入，发现Hp同其它细菌一样存在着不同的类型或亚型。不同类型或亚型的菌株致病力不同，原因在于菌株毒力有差异^［1］。目前比较引人注目的菌株称细胞毒蛋白基因株(cagA^＋株)，cagA^＋株为高毒株，在消化性溃疡患者中占100%，而慢性浅表胃炎中只有50%～60%^［2，3］。笔者采用PCR法检测胃癌和慢性浅表胃炎标本的Hp及其亚型cagA^＋株的感染率，以期探讨Hp-cagA^＋株与胃癌的关系。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　标本　胃癌组标本来自我院石腊存档手术标本共92例，其中早期癌27例，进展期癌65例，贲门部癌36例，胃窦部56例。Lauren分型示肠型癌60例，弥漫型癌32例。慢性清表胃炎标本是我院门诊健康者查体胃镜活检胃粘膜石腊存档标本，共24例。

　　1.1.2　PCR的引物　据关文献^［4］设计如下：

　　1.1.2.1　ureA引物　国家分子生物中心基因分析实验室：①5′GCCAATGGTAAATTAGTT3′；②5′CTCCTTAATTGTTTTTAC3′。

　　1.1.2.2　cagA基因引物　北京赛百盛公司：①5′GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG3′；②5′CTGCAAAAGATTGTTTGCGAGA3′。

　　1.1.2.3　TagDNA聚合酶　dNTPPromega公司。

　　1.1.2.4　标准菌株NCTC11637　中国医科院流行病研究所提供。

　　1.2　方法

　　1.2.1　首先用PCR法扩增HP基因组中ureA，对ureA阳性者再进行cagA基因检测，参照Weiss等方法^［5］，并加以调整。

　　1.2.2　扩增反应　于清洁消毒的0.5mlEphendrof管中进行。反应体系10μl，包括0.5U/μlTagDNA酶1μl，2.5μmol/L引物(含等量的上下两端引物)1μl，2.5μmol/LdNTP(含等量dATPdGTPdCTPdTTP)1μl，消化上清液1μl，25μol/LMgCl₂1μl，覆无菌石腊油10μl。①阳性对照：用1μlHpNCTC11637上清液代替组织上清；②阴性对照：用1μl从人血细胞中提取的DNA代替组织上清；③空白对照：用1μl无菌去离子水代替组织上清。

　　1.2.3　反应条件　①ureA基因：94℃变性15s后45℃退火15s，72℃延伸45s，共35个循环，循环结束后72℃延伸10min。②cagA基因：95℃预变性5min后，94℃变性30s后60℃退火30s，72℃延伸50s，共30个循环，循环结束后72℃延伸5min。

　　1.2.4　结果判定　反应结束后取全部扩增水相电泳，与标准菌株统一水平(DNAMarker比较ureA411bpcagA348bp)出现电泳带为阳性，否则为阴性。

　　1.3　PCR特异性

　　1.3.1　引物特异性　所用ureA引物能特异扩增Hp脲素酶基因A的片段(304～714)，cagA基因引物能特异扩增cagA基因的片段(1228～1576)，对产生脲素酶的克雷白杆菌、白色念珠菌和难辨梭状芽胞杆菌的DNA均无扩增反应。对亲水气单胞杆菌、大肠杆菌、副溶血弧菌的DNA无扩增反应^［4］。

　　1.3.2　扩增特异性　标准菌株NCTC11637即含有ureA基因，又有cagA基因，扩增均出现阳性结果。空白对照未出现电泳带，阴性对照为人血细胞抽提的DNA，未出现电泳带。排除了污染和非特异性扩增的可能。

　　1.4　统计学分析　采用χ²检验，差异显著意义界值为P＝0.05。

　　2　结　果

　　2.1　胃癌和慢性清表胃炎标本Hp-ureA和Hp-cagA^＋亚型株感染的检测结果　胃癌组Hp-ureA检出率高于慢性浅表胃炎组，但χ²检验差异无显著性意义(P＞0.05)。Hp-cagA^＋株检出率在胃癌组显著高于慢性浅表胃炎组(P＜0.01，表1)。

表1　胃癌和慢性清表胃炎Hp-ureA和Hp-cagA基因检出结果

　　^**P＜0.012.2　胃癌不同分期、分型和位置的Hp-ureA和Hp-cagA^＋株检测结果　早期胃癌的Hp-ureA检出率高于进展期(P＜0.05)。肠型胃癌高于弥漫型(P＜0.05)。同样，胃窦部癌检出率高于贲门癌(P＜0.01)。但对于Hp-cagA^＋株的感染，早期胃癌和进展期胃癌，贲门癌和胃窦癌比较，cagA^＋株感染无差异(P＞0.05)。然而，肠型胃癌cagA^＋株检出率明显高于弥漫型，统计学差异显著(P＝0.00135，表2)。

表2　胃癌不同分期、分型和位置Hp-ureA和Hp-cagA基因检测结果

　　^*P＜0.05　^**P＜0.013　讨　论

　　研究已表明Hp存在着不同的亚型。不同的亚型其毒力和致病机制不同。细胞毒蛋白是Hp菌体表面分子量为120～140U蛋白多肽，编码此蛋白的基因称细胞毒蛋白基因。这样的Hp称之为cagA^＋株。大约只有60%的Hp载有cagA基因，cagA^＋株培养2～3d就可见明显的菌落，而cagA^＋株则需要5～6d。cagA^＋株不仅具有一般的Hp毒力因子，如：脲素酶活性，活性氧等，而且能刺激胃粘膜上皮细胞产生IL-8，从而加重炎性反应，而cagA^-株则不能。这说明cagA^＋株对胃粘膜上皮细胞的损伤可能更严重。最近流行病学研究已证实血清cagA抗体阳性的人群其胃癌发病率高于cagA抗体阴性的人群^［6，7］。我们的实验结果也发现，cagA^＋株的感染在胃癌组高于非胃癌组(P＜0.05)。然而，cagA^＋株的感染有自己的特征，即肠型胃癌的感染率显著地高于弥漫型胃癌(P＜0.05)，而与胃癌分期和部位无关。结果提示cagA^＋株与肠型胃癌的发生关系密切，此前也有类似的发现，只是血清学检测结果^［8，9］。但是血清学只能提示感染过Hp，但不能象PCR这样能说明目前感染状态。目前关于Hp致癌机制的基础研究刚刚起步，尤其cagA^＋株的致癌机制报道较少。有研究发现Hp可导致胃粘膜细胞DNA的损伤，进一步导致癌基因突变或过表达，如p53bc1-2基因^［10］。国内张氏等也发现Hp感染和胃癌ras基因突变有关^［11］。Hp感染可导致胃上皮细胞增殖和凋亡失衡，也可能是导致胃癌发生的机制之一^{［12，13］}。当然胃癌的发生是多因素多水平共同作用的结果，Hp作用的具体环节有待于进一步研究。

　　总之，幽门螺杆菌cagA^＋株感染的特点是胃癌患者显著高于浅表胃炎患者，而胃癌病例中又与肠型胃癌密切相关，提示cagA株可能是胃癌发生发展的重要原因之一，特别对肠型胃癌的作用可能更显著。■

　　作者简介：王思平，男，1967-08-12生，山东苍山县人，汉族，1997年军医进修学院硕士毕业，解放军总医院南楼消化科医师；发表论文6篇。电话：(010)66939243

　　作者单位：王思平（解放军总医院南楼消化科，北京　100853；）

　　　　　王孟微（解放军总医院南楼消化科，北京　100853；）

　　　　　吕俊旭（山西省人民医院消化科，太原　030012）

　　参考文献：

　　［1］Xiang Z, Gensini S, Barei PF et al. Analysis of expression of CagA and vacA virulence factors in 43 strains of Helicobacter Pylori reveals that clinical isolates can be divided into two major types and that CagA is not necessory for expression of the vacuolating cytotoxin ［J］. Infect Immun,1995,63(1):94-99.

　　［2］Xiang Z, BugnoiiM, Pozwtto A et al. Detection in enzyme immunoassary of an inmune response to a recombinant fragment of 128kDa protein of Helicobacter pylori ［J］. Eur J Clin Micobiol infect Dis, 1993,12:739-745.

　　［3］Cover TL, Glupozynski Y, Lage AP et al. Serologic detection of infection with CagA^＋ Helicobacter Pylori strains ［J］. J Clin Microbiol,1995, 46(6):1495-1500.

　　［4］Tummuru MK, Cover TL, Blaser MJ. Cloning and expression of a high-molecular-mass majar antigen of Helicobacter pylori evidence of linkage to cytotoxin production ［J］. Infect Immun, 1993,61:1799-1803.

　　［5］Weiss J, Meca J, Slva E et al. Comparison of PCR and other diagnostic techniques for detection of Helicobacter Pylori infection in dyspeptic patients［J］. J Clin Microbio, 1994,32(7):1663-1667.

　　［6］Webb PM, Crabtree JE, Forman D et al. Gastri cancer, Cytotoxin-Associated gene A-positive Helicobacter Pylori, and serum pepsinogens: an international study ［J］. Gastroenterology, 1999,116(2):269-274.

　　［7］Torres J, Guillermo I, Perez-perez et al. Infection with cagA^＋ helicobacter Pylori strains as a possible predictor of risk in the development of gastric adenocarcinoma in Mexico ［J］. Int J Cancer, 1998，78(3):298-303.

　　［8］Crabtree JE, Wyatt JI, Sobala GM et al. Systemic and mucosal humoral responses to Helicobacter Pylori in gastric cancer ［J］. Gut,1993,34:1339-1342.

　　［9］Blaser MJ, Perez-perz GL, Kleanthous H et al. Infection with Helicobacter pylori strains possessing cagA is associated with an increased risk developing adenocarcinoma of stomach ［J］. Cancer Res, 1995,55:2111-2115.

　　［10］Baik SC, Youn HS, Chung MH et al. Increased oxidative DNA damage in helicobacter Pylori infected human gastric mucosa ［J］. Cancer Res,1996,56(3):1279-1283.

　　［11］张锦坤，于　君.幽门螺杆菌与胃癌发生机制关系的分子生物学研究.临床消化病杂志，1993，5(3)：97-99.

　　［12］Moss SF, Calam J, Agarwal B et al. Induction of gastric epithelial apotosis by Helicobacter Pylori ［J］. Gut, 1996,38:498-501.

　　［13］Fan XG, Kelleher D, Fan XJ et al. Helicobacter Pylori increases proliferation of gastric epithelial cells ［J］. Gut, 1996,38:18-22.