幽门螺杆菌感染诊断方法的评价

世界华人消化杂志 1998年第2期第0卷 文献综述

作者：张玲霞　张沥

单位：陕西省西安市中心医院消化科　710003

关键词：螺杆菌，幽门；螺杆菌感染/诊断；尿素酶/诊断应用

　　Subject headings　Helicobacter pylori; helicobacter infections/diagnosis; urease/diagnostic use

　　中国图书资料分类号　R517.9

　　自从1983年Marshall和Warren报道从人胃粘膜活体标本中成功地分离出幽门螺杆菌(Hp)以来，国内外学者进行了广泛深入的研究. 大量资料认为，Hp是慢性胃炎和消化性溃疡的重要致病因素之一，与非溃疡性消化不良和胃癌也有一定的关系. 检测Hp的方法有多种，按是否需要内镜取材分为侵入性和非侵入性检查. 前者包括组织病理学检查、尿素酶试验、细菌培养及基因探针技术；后者包括血清学检查、¹³C及¹⁴C尿素酶呼吸试验. 对上述检测方法进行较全面而客观 的评价，以期对临床工作者在选用检测方法时能有所裨益.

　　1　细菌培养法

　　该方法是诊断Hp的“黄金标准”. Hp分离培养关键在于及时处理标本、培养基和培养条件的选择^［1］. 研究表明，Hp在普通培养琼脂、胰蛋白酶消化大豆、Bruella以及单纯的脑心液等培养基中均不生长，而在这些培养基中加入5%～8%马血清、羊血清或胎牛血清、兔血或羊血方能生长^［2］. 可用于Hp分离的培养基很多，总的可分两大类：一类是非选择性培养基，一类是选择性培养基^［3］. 实践证明，二者均可分离培养Hp，相比之下，后者优于前者，不仅菌落偏大，而且不易生长杂菌. 选择培养基常用Skirrow培养基和MTM(Modified Thayer-Martin)培养基，此类培养基的选择应取决于其中所加的抑制其他菌生长的抗菌物质，如万古霉素(抑制G⁺菌)、多粘菌素(抑制G^-菌)、两性霉素(抑制霉菌和酵母菌)、TMP(抑制变形杆菌)、萘啶酸(抑制其他弯曲菌).

　　Hp对pH的耐受范围为4～10，Shadowen et al^［4］通过实验认为pH 8.5±0.5条件下Hp生长最佳. Hp为微需氧菌，在空气中及绝对无氧环境中均不能生长，在含5%～6% O₂、8%～10% CO₂、80%～85% N₂的 气体环境中生长较好^［5］，一般采用抽气—充分法满足其需要. Hp在30℃～40℃环境下生长，最适宜温度是35℃～37℃，其生长缓慢，一般需5d左右.

　　活检组织的接种主要有四种方法^［2］：①将活检组织剪碎或用乳钵研磨后接种；②活检组织加水于无菌河沙研磨，经1000rpm离心5min，取上清液再以3500rpm离心30min集菌、去上清，取沉淀物接种；③用活检组织的粘膜上皮直接接种；④将活检组织多面直接在分离培养基轻轻压印，然后用接种环划线.

　　该方法能直接证明Hp的存在，无假阳性出现，可作细菌药敏及耐药试验， 可对不同菌株作遗传因子研究. 但其要求的条件和技术较高，且需一定的时间，有时可有假阴性出现.

　　2　尿素酶试验

　　1984年Langenberg发现Hp能够产生大量的尿素酶，该酶具有很高的酶活性，对Hp具有自身保护作用. 它水解尿素，生成氨和二氧化碳，氨能在Hp菌体周围形成一层“氨云”，对抵御胃酸的杀菌作用具有重要意义. 基于此原理，目前已设计了多种检测方法.

　　2.1　pH指示剂法　试剂中含尿素和pH指示剂(如酚红). 从胃内取出的组织活检标本通常呈酸性，pH＜6.0，一般情况下试剂颜色不变. 如果胃内有Hp感染，当标本放入试剂中，Hp所产生的尿素酶则分解尿素产生氨，使pH值升高，导致指示剂酚红变色—粉红色. 1988年，Arvind报道了1min尿素酶试验. 即，用无离子水配制100%的尿素溶液，分装在小管内，每管为1ml加入1%的酚红2滴，pH 6.8，1min看结果，未见假阴性，敏感性为91%. 由于反应时间短，避免了产生尿素酶的污染菌繁殖所致的假阳性. 现国内大部分已应用此方法进行Hp感染的诊断，多采用深圳爱利国医学科开发有限公司生产的1min尿素酶试剂(One-minute urease reagent)及兰州军区卫校生产的尿素酶试剂反应板.

　　2.2　分析化学法　福建三强生化有限公司生产的 cpuP试剂盒属于此种方法，由于阳性显色反应不是取决于试剂中pH改变，可以避免一些影响pH的因素所致的假阳性，敏感性98.6%，特异性100%.

　　尿素酶试验方法简便实用、快速灵敏，能在1min内判断结果，且镜检完后就可及时治疗. 缺点是有一定的假阴性和假阳性，且不能用于治疗后疗效判断.

　　3　组织病理学检查

　　方法较多，有HE染色、Warthin-Starry染色、Giemsa染色、石炭酸复红染色、Gimenez染色、吖啶橙染色、阿的平荧光染色、间接免疫荧光法、相差显微镜观察、无标记抗体PAP染色法、寡核苷酸探针检查等方法. 以Warthin-Starry染色效果最佳.

　　该检测方法繁琐费时，需要一定的技术，有一定假阴性，且敏感性及特异性较差.

　　4　呼吸试验

　　由于Hp在体内产生大量的尿素酶，因此若给感染Hp的患者口服同位素标记的尿素溶液，则尿素分解后产生的同位素CO₂从肺呼出，可收集呼气样本，用液体闪烁计数器或用气体同位素质谱仪检测同位素CO₂的量，根据标记物不同，分为¹³C呼吸试验及¹⁴C呼吸试验.

　　4.1　¹³-C呼吸试验

　　1987年，Graham和Bell首先报道了用该试验诊断Hp感染. 受试者口服¹³C-尿素酶，每公斤体重5mg，随后每10min收集一次呼气标本，连续3h. 如胃内有Hp感染，口服的¹³C-尿素溶液在尿素酶的作用下分解成¹³CO₂，经胃肠道吸收后随呼吸呼出，收集的气体标本质谱仪分析，计算¹³CO₂含量. 有Hp感染者在口服试剂后20min即出现¹³CO₂升高，在100min内持续升高，而无Hp感染者无¹³CO₂呼出.

　　4.2　¹⁴C-呼吸试验　为了克服¹³C-呼吸试验操作复杂、费用昂贵的缺点，Marshall等用¹⁴C-尿素代替¹³C-尿素，检测¹⁴C用液体闪烁计数器即可. 此法也是让患者服用¹⁴C-尿素110～400KBg，收集气体的时间一般从30min至2h. 敏感性89%～100%，特异性 达92%～94%.

　　呼吸试验快速、可靠、安全、无痛苦，国外已将其作为追踪观察治疗效果的最好方法，适合于大规模流行病学调查，表明目前是否有Hp感染， 而不是曾否感染过. 缺点是需要特殊设备，试剂昂贵，对残胃患者，因排空加快可致假阴性.

　　5　血清学检测

　　为一种非创伤性的检测方法，国内外学者对此研究较多，主要包括以下几种^［6］：

　　5.1　尿素酶抗体的检测　由于Hp富含尿素酶，故以尿素酶为抗原采用ELISA检测患者血清中特异性尿素酶抗体. 国外Karnes^［7］报道其特异性为100%，敏感性93%. 此检测对慢性胃炎的诊断有一定价值，但国内尚鲜有报道.

　　5.2　N-乙酰神经氨结合凝集素(NLBH)抗体的检测　Evans et al^［8］从无症状者和分离出的Hp 8826株中提纯NLBH，经证实无尿素酶活性，以此为抗原，行ELISA检测了187例血清，结果发现特异性 88.3%，敏感性75%，消化性溃疡者81.5%可检出NLBH抗体. 故NLBH抗体的检测有可能作为溃疡活动性的指标.

　　5.3　单克隆抗体的应用　Sugiyama et al^［9］发现三株特异性很高的Hp单抗，其中单抗HP₃特异性识别Hp抗原25kd. 以单抗CP₃纯化的25kd蛋白为抗原应用ELISA检测Hp感染的患者血清，结果特异性100%，敏感性96.9%，且慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡患者CP₃抗体滴度明显升高，CP₃滴度与胃炎组织分级显著相关. 故认为检测CP₃抗体可作为胃炎分级的指标.

　　5.4　菌体抗体的检测　补体结合试验、细菌凝集试验、被动血凝试验(PHA)等方法由于敏感性、特异性、可靠性较差，目前已很少采用. 间接免疫荧光法(IF)简单、快速、敏感性和特异性高，可以弥补培养法由于Hp弱、培养过程污染或培养基等因素所致培养阴性不足. 但由于需荧光显微镜，广泛应用受到限制. 免疫印迹法(Immunoblot)^［10］是取数株Hp整菌溶解物经SDS-PAGE电泳所得蛋白转移至硝酸纤维薄膜，取受检血清2ml与薄膜在摇动下室温过夜，洗涤后再分别以碱性磷酸酶标记的兔抗人IgG、IgA和IgM检出与血清中抗体结合的区带. 研究认为，应用此法检查血清IgG和IgA抗体可以肯定诊断感染. 适合于不能作内镜者诊断Hp感染和易感人群的筛选. 但该法操作繁琐，所显示的区带常常不恒定和不特异，给结果判断带来困难. 酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前临床应用最多的方法，其敏感性高、特异性强、稳定性好，可检测不同类型的抗体. Perez-Perez et al^［11］用超声粉碎物作抗原，结果抗Hp-IgG、IgA抗体特异性94.4%，敏感性93.1%，而IgM则无特异性. 目前国内外均已有抗Hp抗体试剂盒供应.

　　由于人群中Hp的感染率在50%以上^［2］，其中约一半的Hp含有细胞毒素相关蛋白基因A(cagA). 可产生细胞毒素相关蛋白A(CagA)的Hp菌株的感染与消化性溃疡的发生有较高的相关性，有些学者甚至认为抗CagA阳性可作为消化性溃疡的一项参考指标. 在胃癌中CagA阳性Hp的感染率也很高，多数报道在95%以上. 发展快速及特异性检测CagA阳性Hp感染的方法具有重要意义. 斑点金免疫渗滤试验(DIGFA)是近几年来发展起的一项新的免疫检测技术，其微孔膜既能吸附蛋白质，又具有快速渗滤及毛细血管作用. 当血清标本通过微孔滤膜时，血清中的抗原或抗体不仅能与膜上的抗体或抗原结合，还能浓集于膜上而加快免疫反应，且胶体金标记物为红色，结合后即显红色斑点，不需加入其他试剂显色. 该方法特异、敏感、简便、快速，一般可在2min～3min内出结果，可单人份或多人份操作，且不需要特殊设备. 适应于大面积、大样本的CagA阳性Hp的筛选，为CagA阳性Hp感染的诊断及流行病原研究带来极大的方便. 目前我科正与第四军医大学全军基因诊断技术应用研究所合作进行Hp CagA基因的体外高效表达及其产物在快速免疫诊断方法上的应用的研究工作.

　　总之，血清学检测对多数标本可同时检测，适用于流行病学调查；血清抗体阳性者，必定为Hp感染，可用于治疗前诊断；并可用于特殊抗体(CagA蛋白抗体)的检测. 但在感染初期抗体效价尚未上升时，可呈假阴性，且不能用于除菌疗效的判断.

　　6　PCR技术

　　PCR是80年代中期发展起来的一项高新分子生物学技术，该技术根据DNA的半保留复制原则，在特异的引物引导下，利用耐热的DNA聚合酶促反应，以4种脱氧单核苷酸为底物，巧妙地应用升温、降温的自动循环过程，在短时间内于体外特异性地将极微量的目标基因(DNA或cDNA)扩增数百万倍以上，从而大大地提高了DNA检测的敏感性. 用于Hp的诊断，其敏感性比寡核苷酸探针增加了100倍，可检出至少100个Hp. 目前Hp的尿素酶基因和16rRNA基因的部分序列已经测出，为PCR特异性引物的选择提供了选择^［12］. PCR技术能准确地评价治疗后的Hp是否被真正根除；可以从石蜡包埋的胃粘膜组织中检测Hp，因此可以对胃及十二指肠患者进行回顾性研究；可以成功地检出人胃粘膜以外的用常规方法不能检出的Hp，包括胃液、唾液、牙菌斑及粪便中的Hp. 用巢式引物双扩增或同时在引物扩增序列内部选择一寡核苷酸作探针，对PCR扩增产物进行Southernblot检测，则可使敏感性增加10～100倍，可检出难以培养的球形Hp^［12］. 但PCR技术可能出现复制的不忠实性、标本的污染和假阳性的出现、非特异性扩增、检测结果的判断失误等问题^［13］. 张沥 et al^［14］研究发现Hp的尿素酶B基因比16SrRNA基因和尿素酶A基因、2.4kb克隆片段具有更高的属特异性和保守性，且能防止形成二聚体或多聚体，有利于在短时间内进行完整片段的扩增，从而设计出了最佳的引物序列，形成独特的巢式PCR. 他们采用该方法对214例胃病患者进行Hp检测，检出率为61%，较尿素酶试验及银染色法者高. 该PCR程序省略了样品的准备过程，减少了试剂及仪器使用的种类及时间，使假阳性 发生率大为降低. 屈汉庭 et al^［15］用改良式聚合酶链反应检测Hp，他们采用dUTP替代dTTP，并在反应体系中加入0.4U的UCG，可有效地控制扩增产物污染造成的假阳性，将此法与组织病理学检查、尿素酶试验、酶联免疫吸附试验及细菌培养相比较，结果显示PCR是5种方法中最敏感的方法. 改良后的PCR法不仅保持了高度的敏感性及特异性，而且简化了操作步骤，克服了易污染的弊端. 故有人认为^［16］，只有建立规范化技术程序和质控体系，严防前次反应产物及工作人员携带的污染，设立阴性对照，方可避免假阳性发生，保持其高度的敏感性及特异性.

　　总之，在Hp感染的诊断方法中，细菌培养、组织病理学检查、尿素酶试验、呼吸试验等方法或因为需要一定的条件和技术，或因为需要特殊仪器，或因为费用昂贵等，使临床推广及多次重复受到限制. 血清学检测非创伤性，可同时处理大量标本，可检测不同类型的抗体，以ELISA法目前临床应用最广泛，但以斑点金免疫渗滤试验(DIGFA)更特异、敏感、简便、快速. 但该法在感染初期可呈假阴性，且不能用于除菌疗效的判断. PCR技术能准确评价治疗后Hp是否被真正根除，不仅可以从石蜡包埋胃粘膜组织中检出Hp，对胃及十二指肠患者进行回顾性研究，而且可以成功地检出人胃粘膜以外的用常规方法不能检出的Hp，包括胃液、唾液、牙菌斑及粪便中的Hp,具有高度的敏感性和特异性，可检出难以培养的球形Hp. 如能建立规范化技术程序和质控体系，采取独特的巢式PCR，省略样品的准备过程，减少试剂及仪器使用的种类和时间，严防前次反应产物及工作人员携带的污染，并设阴性对照，作者认为PCR法无疑是目前Hp所有检测方法中最为敏感、最为特异且假阳性率最低的检测方法.

　　通讯作者　张玲霞

　　收稿日期　1997-09-30　修回日期　1997-11-02

　　7　参考文献

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