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聚合物微粒包裹幽门螺杆菌疫苗的研究

聚合物微粒包裹幽门螺杆菌疫苗的研究

世界华消化杂志 2000年第4期第8卷 文献综述

作者:王缚鲲 王缚鲲 于长青 邹全明

单位:王缚鲲(中国民解放军白求恩国际和平医院 重庆市 400038) ;王缚鲲 于长青 邹全明(中国民解放军第三军医大学临床微生物教研室 400038)

关键词:螺杆菌,幽门;疫苗;微粒;螺杆菌感染

   幽门螺杆菌(Hp)是一种微需氧的革兰阴性菌,电镜下它是一种单端多鞭毛、天端钝圆、菌体作螺旋形弯曲的细菌,它定植在类上消化道,尤其是在胃中,现已证明Hp感染非常普遍,而且它是引起B型胃炎、消化道溃疡以及粘膜相关性淋巴组织(NALT)淋巴瘤等疾病的主要致病因子[1].目前主要依靠抗生素清除Hp,虽然Hp在体外对多种抗生素敏感,但是在体内抗生素治疗往往不能奏效,即使有效也不能阻止Hp的再次感染[2].许多研究员尝试了通过口服疫苗来阻断Hp的感染,口服疫苗是诱导粘膜免疫力,从而防止Hp感染的一种安全、方便的方法[3]。1Hp的致病机制Hp能在酸性环境中生存是其定植和致病的关键,尿素酶和某些蛋白对于抵抗胃酸起重要作用,经尿素酶分解尿素产生的氨可在Hp周围形成“氨云”,中和其周围的胃酸起着保护作用[4],热休克蛋白在应激时可以保护其他蛋白质的结构完整,在对胃酸的抵抗作用中起着复杂的作用[5].另外,Hp还能分泌一些抑制胃酸分泌的蛋白,Hp产生的过氧化物歧化酶(SOD)和触酶,能保护其不受中性粒细胞的杀伤作用[6].Hp所具有的较强的动力,也是其较强致病力的重要因素,Hp一旦穿过粘膜层,就会粘附在胃上皮表面,Hp紧密粘附与胃上皮表面可避免使其与胃内的食物一道被排空,亦使其毒素容易作用于上皮细胞,正常胃粘膜可防止Hp反句弥散,当粘膜受到Hp的损害时,尿素酶产生的氨能降低粘液中粘蛋白的含量,破坏粘液的离子完整性,削弱屏障功能,造成H+反向弥散;空泡毒素VacA能使细胞造成不同程度的空泡变性;磷脂酶A能把软脂卵磷脂降解为游离软脂酸和溶血卵磷脂,破坏细胞的完整性,脂酶和磷脂酶A可以分解粘液中的脂质和磷脂,破坏粘液的屏障功能[7]。Hp的致病机制仅包括尿素酶、空泡毒素等的直接损伤,也包括Hp引起宿主的炎症及免疫应答致病,Hp感染后可观察到胃粘膜细胞变性、坏死、炎症细胞浸润,血清中可检测到特异性抗体。炎症和免疫反应造成胃粘膜屏障的损害,导致一系列疾病的形成[8]。2Hp的保护性免疫基础Czinn和Nedrud用Hp的超声上清,辅以霍乱肠毒素(CT)为佐剂对小鼠和雪貂进行了口服免疫,在肠道分泌物中观察到抗Hp的分泌型lgA(SIgA)有上升趋势,然后口服lO8个活Hp,动物几乎100%得到了保护,大量研究证明特异性的分泌性IgA能够防止细菌和病毒在粘膜表面定植和进一步感染,粘膜表面的SIgA可抑制细菌抗原的摄取、阻止Hp的粘附和移动以及中和毒素、即SIgA在Hp感染中起保护性免疫作用。由于IgA不能有效地激活补体.从而在阻滞Hp特异性IgG介导的补体活化及相关的中性粒细胞活化炎症递质释放中起重要作用,另一方面,细菌受抗体包被后可诱发多型核粒细胞(PMN)或单核细胞/巨噬细胞的吞噬作用[9]。在免疫应答中起更重要作用的成分是T细胞,根据细胞因子分泌谱,辅助性T细胞(Th)淋巴细胞可分为两个亚群:Thl和Th2细胞.Thl细胞分泌干扰素(IFN-γ)、白个素2(IL-2)和β-肿瘤坏死因子(TNF-β),而Th2细胞产生IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,在β感染时,Th1应答/以为主要的.相应的Th1细胞因子谱导致胃粘膜下层炎症和损伤加剧,引起典型胃炎,然而,就清除细菌而言,此型应答对Hp感染无效.在小鼠模型中,保护作用和炎症消退显然与Thl应答到Th2应答的转变相关,后者可由佐剂诱发.因此,佐剂的选择是关键步骤,决定其一抗原能否诱导保护作用[10]。3Hp疫苗研究中佐剂的使用在大多数成功免疫的试验中、一般以CT和大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)为粘膜佐剂,虽然小鼠可以忍受CT和LT,但是对于类它们存在潜在的毒性,普遍认为CT不能在最终的疫苗产品中使用,而且对于LT减毒分子也有许多不明之处[11]。虽然最近LT的去毒突变体和CT的无毒B亚单位对体无毒,但是其免疫原性却增高了,目前需要有关它们在体中应用的大量数据,所以,必须开发一种更有效的新型佐剂[12]。最近、有许多试验证明了用生物可降解的而且生物相容性良好的微粒作为粘膜佐剂,经口服免疫可诱导全身及局部免疫应答.众多的天然和工合成的聚合物在试验中应用,特别是生物可降解的丙交酯与乙交酯的共聚物(PLG).它在临床己安全使用多年[13].PLG可用来制造释控传递系统等,经口服免疫或胃内给予疫苗(卵清蛋白、多肽、细菌毒素以及全菌)后,能产生很强的粘膜抗体反应,通过口服疫苗可产生粘膜和全身体液免疫,而且可诱导细胞毒性T细胞(CTL)反应[14].所以,以上结果显示微粒作为新型佐剂具有许多潜在优势。4聚合物微粒包裹疫苗的优点和作用机制疫苗经口服较肠道外接种安全、简单、耐受性好,投递于胃肠道粘膜表面后,经相关淋巴组织可进入其他粘膜淋巴组织,从而在更广的范围内产生粘膜免疫,由于非复合型口服疫苗缺乏合适的投递系统,所以当前大多数疫苗仍采用注射免疫,目前已考虑用微粒技术投递口服疫苗,用微粒作口服疫苗载体有以下优点[15]:①抗原经微粒包裹后可避免被胃酸及消化道酶分解;②抗原经微粒包裹后可促进肠集合淋巴结,即派伊尔结(PP)对其摄取;③可同时投递几种抗原;④具有佐剂活性;⑤具有储库作作,可将抗原源源不断地呈递给免疫细胞;⑥可同时包裹细胞因子和佐剂;⑦载体基质本身无免疫原性,可进行重复性接种,用微粒作口服疫苗载体的作用机制包括:①微粒具有靶向性,粒径≤10μm疏水性微粒易靶向PP,可被特殊上皮细胞-M细胞摄取并转运到深层PP,≤5μm微粒被巨噬细胞吞噬并随淋巴引流进入系统淋巴组织,诱导系统(循环)免疫反应;而>5μm微粒滞留在富含B细胞的PP内,受抗原致敏的B细胞迁居于各种粘膜组织,从而诱导局部及全身散在粘膜分泌型IgA(sIgA)抗体免疫反应[16]口服1μm~10μm微粒可同时激活全身粘膜和系统免疫反应.②微粒具有佐剂活性,粘膜免疫反应中微粒的佐剂作用机制尚不明确,微粒聚合物的物理结构可能通过促进抗原呈递细胞(APCs)对抗原的识别加工、处理来增强免疫反应,而且微粒可将高浓度抗原有效投递给PPAPCs并被呈递给T细胞,产生强刺激,增强免疫效果[17]。③储库作用,随着聚合物的降解,微粒可缓释或脉冲式释放抗原;减少接种次数,④除诱导CD41Th2型粘膜与血清抗体反应外,还可在粘膜表面诱导有效的细胞毒性T细胞(CTL)应答,因此可同时产生细胞与体液免疫,保护宿主抵抗各种病原体的侵袭[16],总之,口服免疫时,耐受原转变成免疫原的过程中,微粒的靶向投递和佐剂活性是两个重要的决定因素。5聚合物微粒用于Hp疫苗的研究最近Kimetal[18]用PLG包裹Hp超声上清,首次报道将聚合物微粒用于Hp疫苗的研究.PLG是近年来用于投递疫苗最多的一种微粒,具疏水性和淋巴定向性,非酶性水解,可通过改变其分子量或单体构成比调整其缓释和控释效果.PLG为白色或棕黄色微粒,M,1~50万,粒径平均1μm~300μm,对蛋白抗原囊化率一般在10%左右,被囊化的抗原以脉冲或连续释出,可冻干,不需冷链,T1/26mo左右,生物降解成乳酸和羟基乙酸,无毒性,Kimetal使用的PLG是由丙交酯和乙交酯单体以50/50的比率共聚而成,抗原包裹应用溶剂蒸发法或液中干燥法,微粒的直径经测定在0.53μm~O.86μm之间;用扫描电镜观察其表面,与Kofleretal[19]报道用溶剂蒸发法制作的微粒是表面粗糙的多孔的微粒不同,所有微粒都是球型、表面完整且光滑,空微粒和载抗原微粒没有差别,微粒中62%~75%载有抗原,而且微粒包裹时对各种抗原无选择性.从微粒中抽提出的抗原通过SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析,结果显示抽提出的抗原没有发生降解和聚合、免疫原性也没有发生改变。Kim将载有抗原的PLG悬浮于7.5%NaCO3中以便在饲喂时能的抗胃酸,每组3只6周龄♀Balb/C小鼠分别在0,1,2wk口服含1mgHp的微粒,在wk8进行相同剂量的加强免疫,对照小鼠每只口服抗原1mg或1mg抗原与10μgCT的混合物,免疫时间、次数与口服微粒组相同,用ELLSA法检测IgA,用ELISPOT法检测小肠固有层(LPL)中特异性抗体(IgA)分泌细胞,口服可溶性抗原的小鼠在其肠道冲洗液中未检测到IgA,在其血清中末检测到IgG;口服可溶性抗原与CT混合物的小鼠在wk4即可在肠道冲洗液中检测到lgA,在血清中检测到lgG.在加强免疫后两抗体效价急剧增高;口服PLG-Hp的小鼠在wk4和wk8两抗体效价很代,加强免疫后于wk9上升,结果显示肠道冲洗液中lgA的含量和小肠固有层特异性抗体分泌细胞量具有良好的相关性。在体外试验中,散微粒中抗原释放方式受以下几个因素影响:聚合物的分子量、大小以及乙交酯和丙交酯的比例,不同的制作条件可导致聚合物降解、抗原释放方式不同,从而影响抗体的产量,但在本次体内试验不同分子量的微粒诱导抗体产量没有差别,恰当的解释是试验中使用的微粒均为快速释放型,wk9时在体内都已完全降解,所以体内、外试验结果有差别。最近Gomez-Duarteetal[20]报道利用减毒沙门菌作为载体,但在消化道中和血清中针对Hp尿素酶的抗体都极低,虽然PLG-G-Hp诱导的抗体水平较以CT为佐剂诱导的低,且不清楚其是否足够起到免疫保护作用,Kim仍希望通过PLG-Hp起到免疫预防和治疗作用。目前利用聚台物微粒包裹Hp疫苗正在积极研制之中,我们实验室正进行聚乳酸类生物降解材料包裹Hp疫苗的研制,并取得了初步成果,急需进行应用不同粒径、不同成分的微粒包裹一种或几种保护性抗原的矿究.微粒包裹疫苗安全,并且具有缓释作用、佐剂活性及靶向投递等优点,所以它的应用必将使Hp疫苗的研制进入一个新的天地。

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收稿日期:1999-12-22


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下一编:幽门螺杆菌清除前后胃粘膜C-myc蛋白和表皮生长因子受体的变化
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