日本血吸虫病患者血清对噬菌体随机7肽库的免疫筛选
细胞与分子免疫学杂志 2000年第2期第16卷 分子免疫学
作者：舒新华 易新元 曾宪芳
单位：舒新华（湖南医科大学寄生虫学教研室 ，湖长沙410078）；易新元（湖南医科大学寄生虫学教研室 ，湖长沙410078）；曾宪芳（湖南医科大学寄生虫学教研室 ，湖长沙410078）
关键词：日本血吸虫病；免疫筛选；噬菌体随机多肽文库
摘要:目的 从噬菌体随机多肽文库中，筛选出能与慢性血吸虫病患者血清特异性结合的短肽分子。方法 采用慢性血吸虫病患者血清免疫球蛋白(Ig)作为配基，免疫筛选以融合蛋白形式在丝状噬菌体M13外壳蛋白III表达的随机7肽文库。按吸附－洗脱－扩增的淘筛过程，经3轮免疫淘筛后，随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性，并用斑点ELISA分析其诊断血吸虫病的价值。结果 经3轮免疫淘筛后，特异性结合的噬菌体富集增加近100倍。用ELISA检测第3轮筛选后随机挑取的30个噬菌体克隆，有26个克隆能与慢性血吸虫病患者的血清Ig产生特异性反应，其中A值最高的2个克隆具有诊断血吸虫病的潜在价值。结论 噬菌体随机肽库技术，可应用于分析、鉴定血吸虫抗原表位，继而为获得亚单位表位水平的诊断试剂和抗血吸虫 病的短肽疫苗提供依据。
中图号：R532.21 文献标识码：A
文章编号:1007－8738（2000）02－0109－04
Immunoscreening of phage random peptide library with sera from patients with schistosomiasis japonica
SHU Xin-hua YI Xin- yuan ZENG Xian-fang
（Department of Parasitology, Hunan Medical University, Changsha 410078,
Hunan Province, China）
Abstract:Aim To obtain the short peptides through screening phage random peptide library with sera fromschistosomiasis patients. Methods Specific Ig was purified from sera of patients with chronic schistosomiasis and usedto immunoscreen a phage random peptide library of 7 anmino- acid residues displayed as a fusion protein on shell
protein III of filamentous phage M13. The positive clones were obtained through three rounds of biopanning; thereactivity of each clone bound to specific Ig was examined by ELISA. The specific clones were used to examine serafrom schistosomiasis patients by Dot- ELISA. Results The eluted phages were enriched nearly to 100 fold throughthree rounds of biopanning. In 30 phage clones selected randonly from the third round biopanning, 26 clones of themcould bind to the specific Ig. Two clones with highest A595 value in positive clones had a potential role inimmunodiagnosis of schistosomiasis. Conclusion Schistosome- specific antigenic epitopes can be identified by thetechnique of immunoscreening phage random peptide library using infected patient sera and these epitopes pay thefoundation for preparing immunodiagnostic reagent or vaccine.
Keywords: Schistosomiasis japonica; immunoscreening;phage random polypeptide library
1985年，Smith〔1〕将外源基因插入丝状噬菌体f1的外壳蛋白质基因III区，使目的基因编码的多肽在噬菌体表面表达，从而建立了噬菌体表面表达技术。Scott等〔2〕利用该技术首次构建了噬菌体随机6肽文库。随后有人又构建了7肽库、8肽库、9肽库、12肽库和15肽库等，最大的为38肽库〔3〕。利用肽库技术，可分析抗原表位和细胞表面受体，研究蛋白质的相互识别及相互作用，并可寻找细胞内的信号传递蛋白。肽库技术在细菌、病毒及原虫的研究方面已广泛应用，但用于血吸虫病的研究迄今未见报道。我们从噬菌体随机多肽文库中，筛选出能与慢性血吸虫病患者血清特异性抗体相结合的短肽分子， 及其在血吸虫病诊断中潜在的应用价值。
1 材料和方法
1.1 慢性血吸虫病患者血清Ig的制备 慢性血吸虫病患者的血清，采自血吸虫病重疫区湖南省汉寿县波头镇粪检阳性的患者。将10例患者的血清混合，用400g/L硫酸铵沉淀3次，沉淀后经透析，以0.2mol/LPBS(pH7.2)平衡及浓缩后，测定蛋白浓度，并与日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)做间接ELISA，检测所制备的I g的活性。
1.2 噬菌体和菌株 以丝状噬菌体M13为载体，构建的随机噬菌体7肽库(Ph.D.Display phage peptide library)，由Larry McReynolds教授(New England Biolabs,INC)惠赠。肽库滴度为2×1016pfu/L。受体菌为 E.coliER2537。
1.3 噬菌体多肽库的淘筛 制备的慢性血吸虫病患者血清Ig做1∶400稀释，每孔加100μL包板4℃过夜，用30g/L脱脂牛奶于37℃封闭2h。以TBST(50mmol/LTris-HClpH7.5，150mmol/LNaCl及0.5mL/LTween-20)洗涤5次后，每孔加入噬菌体肽库100μL(约含2×1010pfu)，室温下轻摇震荡1h。用TBST洗涤10次，洗去未结合的噬菌体，每孔加入洗脱液(0.2mol/LGly-HClpH2.2及1g/LBSA)，室温下轻摇震荡8min。吸取洗脱液，加入15μL中和缓冲液(1mol/LTris-HClpH9.1)中和。中和后的洗脱液除留一部分做滴度测定外，其余加到过夜培养的E.coliER2537中使之增殖。在37℃震荡培养4.5h后，于4℃离心(10000r/min)10min。吸取上清，加入150mL/L的PEG-NaCl(200g/LPEG-8000，2.5mol/LNaCl)沉淀过夜。沉淀后，4℃离心(10000r/min)15min，噬菌体即被沉淀于管底。然后用TBS溶解，将Ig做1∶800稀释，每孔包板100μL，封闭后加入第1轮扩增的噬菌体肽库，再进行第2轮淘筛和扩增。将Ig按1∶1600稀释，每孔加入100μL包板，封闭后加入第2轮扩增的噬菌体肽库，进行第3轮淘筛和扩增。最后计算每一轮淘筛后的噬菌体回收率。 计算公式如下：
回收率(％)=(洗脱的噬菌体克隆数/洗脱前加入的噬菌体克隆 数)×100％
1.4 特异性结合的噬菌体克隆的鉴定 采用间接ELISA法。经3轮淘筛、洗脱后的噬菌体，测定其滴度并稀释后，取10μL加入到经37℃培养24h的E.coli ER2537菌液中。摇匀后，于室温静置20min，转入含3mL agarose top的小管中，混匀后，立即倒入LB平板，于37℃倒置培养。随机挑取30个噬菌斑，分别置于1mL过夜培养的E.coli ER2537中。37℃振荡培养4.5h后，离心、取上清，按淘筛中的纯化步骤纯化并测定其滴度。用TBS稀释后，按100μL/孔包板，再以30g/L脱脂奶粉封闭后，加入慢性血吸虫病患者的血清Ig(1∶200)，于37℃作用2h，加入HRP标记的羊抗人IgG，经TMB显色后，以E960酶标仪测定波长为595nm的吸光度(A值)。同时用原始肽库包板作为阴性对照。以测试样品的A595nm与参考阴性A595nm的比值(S/N)≥2.1判为阳性。
1.5 NC膜斑点印迹诊断慢性血吸虫病 纯化的阳性噬菌体克隆用TBS稀释后，取5μL点于NC膜上。室温干燥后，用30g/L脱脂奶粉封闭，分别加入10份慢性血吸虫病患者的血清和10份正常人血清(均由本室血清库提供)。同时加入慢性血吸虫病患者混合血清和正常人混合血清分别作为阳性和阴性对照。于37℃作用2h，加入HRP标记的抗人IgG，DAB显色后，按文献〔4〕的方法判断阴阳性。
1.6 Western印迹分析 取扩增并纯化的阳性噬菌体克隆(滴度为5.2×1016pfu/L)，按Ruppel等〔5〕的方法进行SDS-PAGE，分离胶为100g/L的单一胶，标准相对分子质量(Mr)为预染的蛋白分子(Mr6000～175000，New England Biolab产品)。电泳后电转移到NC膜上，用30g/L脱脂奶粉封闭后，加入慢性血吸虫病患者血清Ig。以后的步骤同1.4。实验中用原始肽库作为阴性对照。
2 结果
2.1 慢性血吸虫病患者血清Ig免疫活性的测定 慢性血吸虫病患者混合血清10份盐析后所获Ig的蛋白质浓度为7.86g/L。用SEA包板做间接ELISA检测其免疫学活性的结果显示，稀释至6400倍时仍有很强的免疫学活性。
2.2 阳性噬菌体克隆的筛选 以慢性血吸虫病患者血清Ig包板，经过3轮淘筛，检测每一轮淘筛的回收率。在每轮淘筛后，降低包板Ig的浓度，以获得高亲和力的噬菌体克隆。在包被
抗体量不断下降的情况下，每一轮噬菌体的回收率却在逐步上升(表1)，说明每轮淘筛所获得的特异性噬菌体克隆在不断富集(enrichment)。第3轮洗脱下的噬菌体量较第1轮洗脱下的产量高 出近100倍。
表1 淘筛过程中噬菌体克隆的回收率(％)
Tab1 Recovery rate of phage clones during biopanning(％)
| Panning
(round) |
Ig used
(μg) |
Phage added
(pfu) |
Eluted phage
amount(pfu) |
Recovery rate
(%) |
| 1 |
1.97 |
2×1010 |
6.9×105 |
3.45×10－5 |
| 2 |
0.98 |
3×1010 |
7.2×106 |
2.40×10－4 |
| 3 |
0.49 |
3×1010 |
5.4×107 |
1.80×10－3 |
2.3 特异性噬菌体克隆的ELISA鉴定 将第3轮淘筛后洗脱下的噬菌体，感染受体菌E.coli eR2537后，随机挑取30个噬菌斑，制备原种。将其用TBS稀释成4×1014pfu/L包板做间接ELISA，检 测其与慢性血吸虫病患者血清Ig的反应性。同时，以原始肽库作为阴性对照，其阳性率为86.7％(图1)。
图1 特异噬菌体克隆与慢性血吸虫病患者血清Ig的反应
Fig1 Immunoreactivity of specific phage clones to serum Ig from
patients with schistosomiasis japonica
P0∶Original peptide library(negative control)；P1～P30:Specific phage clones.
2.4 阳性噬菌体克隆的斑点印迹 从经ELISA鉴定的特异性噬菌体克隆中，选择出2个A595nm值最高的克隆(P12和P15)。用TBS稀释到3×1015pfu/L后，取5μL点于NC膜上，做免疫斑点印迹实验。结果(图2)显示，以P12检测的10份慢性血吸虫病患者的阳性率为90％(9/10)，而用其检测的10份健康人中只有1人出现阳性反应，阴性率为90％(9/10)；用P15检测的慢性血吸虫病患者的阳性率为100％(10/10)；而检测健康人的结果均呈阴性(0/10)。
图2 噬菌体克隆P12和P15的dotELISA
Fig2 Dot ELISA of phage clones P12 and P15
A1～A10:Sera of schistosomiasis patients;A11:Pooled sera of schistosomiasis
patients(positive control);A12:Pooled normal sera(negative control);
B1～B10:Normal sera;B11:Pooled sera of schistosomiasis patients
(positive control);B12 :Pooled normal sera(negative control).
2.5 Western印迹分析 为了确证慢性血吸虫病患者血清Ig亲和结合的部位，为融合在噬菌体PⅢ蛋白上的短肽，以原始肽库作为阴性对照，进行了Western印迹分析。结果(图3)显示，慢性血吸虫病患者血清Ig能特异性地结合于PIII融合蛋白的部位，即 相对分子质量(Mr)为42000的位置。
图3 噬菌体克隆的SDS-PAGE及Western印迹分析
Fig3 SDS-PAGE and Western blot analysisof phage clones
A:SDS-PAGE of phage clones;B:Western blot of phage clones;
M:Marker(Mr);1:SDS-PAGE pattern of clone P12(silver staining);
2:SDS-PAGEpattern of clone P15(silver staining);
a,b:Original phage library incubated with specific Ig from the patients;
c:Phage clone P12 incubated with specific Ig from the patients;
d:Phage clone P15 incubated with specific Ig from the patients.
3 讨论
日本血吸虫病是我国五大寄生虫病之一，严重危害人民的身体健康。经过40多年的努力，血防工作已取得举世瞩目的成就，血吸虫的感染率及感染度正在下降，使得以粪便检查虫卵的病原学诊断变得更加困难，所以当前主要采用免疫学方法来诊断血吸虫病。免疫学检查目前以检测患者体内的特异性抗体为主，所用抗原多为复杂的粗抗原(成虫抗原和虫卵抗原)，患者体内针对粗抗原的抗体可保持较长时间，甚至经过有效治疗后粪便中已查不到虫卵时，特异性抗体仍长期不消失，因此，难以区别活动性感染和既往感染，也无法反映治疗的效果〔6〕。同时，由于日本血吸虫和华支睾吸虫〔7〕、并殖吸虫〔8〕及旋毛虫〔9〕具有共同抗原，因此，检查抗体尽管诊断血吸虫病的敏感性高，但特异性并不理想，常出现交叉反应。为解决上述问题，必须寻找更为敏感和特异的抗原表位，以降低交叉反应；或寻找某些能刺激宿主产生短程抗体的抗原表位，通过测定针对该表位的短程抗体来进行诊断。肽库技术为寻找这些功能性的抗原表位提供了契机。
早期人们主要利用单克隆抗体(mAb)来淘筛噬菌体随机多肽文库，以获得针对该mAb的表位。Motti等〔10〕以两株抗HBsAg的mAb，从随机15肽文库中筛选出4株能与mAb特异性结合的噬菌体克隆(噬菌体表位，phagotope)。其中1个表位能特异性地识别HBsAg免疫的人血清，显示出诊断乙型肝炎的潜在价值。Folgori等〔11〕在对HBV抗原表位的研究中，采用了更为新颖的技术路线，
即用多克隆抗体直接筛选噬菌体随机多肽文库，这样可能获得一系列具有诊断价值的抗原表位。他们用乙型肝炎患者的血清，筛选随机噬菌体9肽文库，获得的15个噬菌体克隆中，有两个克隆用于检测健康人的血清有很好的特异性(阴性率都为100％)；诊断乙型肝炎患者有较好的敏感性(阳性率分别为65％和70％)。本研究中，采用了该技术路线，即用慢性血吸虫病患者混和血清中的Ig，淘筛噬菌体随机7肽文库。经间接ELISA检测，获得的30个噬菌体克隆中有26个克隆可与慢性血吸虫病患者混和血清发生免疫反应，其中2个A595nm值最高的克隆，对血 吸虫病的诊断具有较好的敏感性和特异性。
以我们用慢性血吸虫病患者的血清Ig，从噬菌体随机7肽文库中获得具有诊断价值的噬菌体表位的启示，可以想象，对目前具有诊断价值的粗抗原(如成虫抗原、虫卵抗原)或蛋白分子抗原(如成虫31000/32000抗原、碱性磷酸酶抗原和原肌球蛋白抗原)的表位，也可用肽库技术进行分析。同样，也可利用该技术分析、鉴定目前已证明具有免疫保护效果的抗原分子(如Sj26,Sj14和Sj97等)的抗原表位，使研制抗血吸虫感染的高效短 肽疫苗成为现实。
基金项目：国家九五医学科技攻关项目资助，No.96-06-04- 04
作者简介：舒新华，男，30岁，讲师，博士 长沙市湘雅路88号,Tel.(0731)4474411-2776
Email.Zhour@public.cs.hn.cn 2000byJCellMolImmunolPress
www.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
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收稿日期：1999－06－21
修回日期：1999－09－08
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