SIEA免疫后的感染血清体外培养日本血吸虫未成熟卵鉴定抗卵胚胎发育候选分子
中国地方病学杂志 1999年第1期第18卷 实验观察
作者：杨明义 董惠芬 余祖江 蒋明森 李 瑛 钟沁萍
单位：（湖北医科大学寄生虫学教研室，武汉 430071）
关键词：血吸虫；日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原；血清；保护性免疫
【摘要】 目的 筛选SIEA抗卵胚胎发育的候选分子。方法 小鼠再感染日本血吸虫尾蚴用SIEA免疫后49天，实验组收集该免疫血清培养日本血吸虫未成熟卵。对照组用未免疫小鼠相同天数感染的血清培养，2天后，收集虫卵，作免疫沉淀和SDS—PAGE分析。结果 发现实验组仅出现54KD。结论 日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原中54KD分子可能位于未成熟卵膜或基质中，由未成熟卵所释放，为SIEA诱导保护性免疫中主要的效应分子。
分类号 Q958.9 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)01-0007-09
Identifying candidate molecule of anti-embryonation through cultivating the immature eggs by infected serum after immunity with SIEA
YANG Mingyi,DONG Huifen,YU Zujiang,et al.
Department of Parasitology,Hubei Medical University,Wuhan 430071
【Abstract】 Objective The study aims on sifting the candidate molecule of anti-embryonation.Methods The immature eggs were cultivaed with sera from mice immuned by Schistosome japonicum soluble immature egg (SIEA) and infected later or normal infected sera respectively.Two days later,the eggs were collected,immune preciapated,and analysed by SDS-PAGE.Results 54KD was the only common band in sample from the eggs cultivated by infected sera after immunity;no band in eggs cultivated by infected sera was found.Conclusion The resluts indicated that the immunity elicited by 54KD of SIEA may play a important role in anti-embryonation.
【Key words】 Schistosoma japonicum SIEA Sera Protective immunity
有关日本血吸虫病疫苗的研究，目前大多数集中于抗感染疫苗研究，迄今最有希望抗感染疫苗也只诱导部分保护力，随着研究深入，暴露出许多难以克服的缺点，抗血吸虫卵胚发育疫苗显得具有重要意义，SIEA（日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原）具有明显抗卵胚胎发育作用[1，2]。SIEA 67KD至26KD蛋白中，许多蛋白具有诱导体液免疫能力，其中49.6KU(即54KD分子)或33.7KU（即40KD分子）蛋白可能在SIEA诱导保护力起重要作用，能在虫卵内形成沉淀[3]。为了进一步寻找可靠的依据，本研究首次采取SIEA免疫后的日本血吸虫感染血清和未成熟虫卵混合培养，SDS—PAGE分析，旨在为抗血吸虫病理疫苗候选分子筛选提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器 丙烯酰胺、双丙烯酰胺为日本Nacalai产，SDS为美国Sigama产，电泳仪和转印仪为日本Bio-Rad(3000xi型)，其余仪器和试剂均为国产。
1.2 新鲜未成熟卵来源 常规感染健康家兔2只，尾蚴3000条/只（阳性钉螺由湖南省寄生虫病研究所提供），感染34天后，取肝脏捣碎，快速收集未成熟虫卵共0.2ml，生理盐水洗涤3次，离心每次5分钟。
1.3 血清制备 昆明系雌性小鼠若干只（湖北省医科院提供），随机分为对照组和实验组，各组佐剂均用完全弗氏佐剂，对照组注射生理盐水；实验组注射SIEA，注射剂量0.3mg/只。分3次经皮下注射，每次间隔10天，第3次免疫后第8天，实验组取10只小鼠按常规收集血清，经琼脂双扩散测得效价为1：4，各组小鼠按常规腹部贴片，攻击感染尾蚴40条/只。攻击感染后第49天，摘眼球取血，获得免疫后感染血清。同时获得相同天数对照组血清。滤膜过滤，无菌保存待用。
1.4 上样前抗原制备
1.4.1 将两组等压积新鲜未成熟虫卵各
0.1ml多次无菌洗涤，转入无菌培养瓶中，各加入5ml RPMI—1640培养基。其中对照组加入小鼠感染血清。实验组加入SIEA免疫后感染血清，终浓度均为20％，37℃，培养2天[4]。
1.4.2 培养后虫卵分别收集，离心，生理盐水冲洗各3次。洗涤后的虫卵，匀浆4℃冷浸48小时，离心（10000rpm/min）30分钟，留上清，取上清按李允鹤法[5]制备得抗原抗体复合物，即为上样前抗原。同时将SEIA免疫组小鼠肝内虫卵按相同方法制得抗原抗体复合物，也为上样前抗原。由于对照组制得沉淀极少，无法测量。样品1为实验组免疫复合物，样品2为标准蛋白，样品3为SIEA，样品4为前述SIEA组肝内虫卵免疫复合物。
1.5 SDS—PAGE 按照石佑恩方法[6]，浓缩胶12％，稳流25mA，电泳1小时。凝胶考马斯亮兰R—250染色，脱净底色，照相。
2 结果
根据标准分子量迁移率Rf值，用半对数纸测得样品组份分子量，根据考马斯亮兰染色浅深区别主次带。
样品1：仅一条带54KD。样品2：标准蛋白。样品3：主带66～67KD、54～50KD，次带96KD、40KD、31/32KD、28/26KD、24KD。样品4：主带67KD、54KD，次带31KD。
图1 SDS—PAGE结果
注：样品1，免疫感染后血清与未成熟卵培养后抗原抗体复合物；样品2，标准蛋白；样品3，
SIEA；样品4，SIEA组小鼠肝内虫卵内抗原抗体复合物。
3 讨论
施行自动免疫接种的机体，经过一定时期诱导后，可产生相应抗原的特异免疫力，其特点为特异性、多样性、回忆性及作用缓慢[7]，其中记忆细胞形成是回忆性应答基础。
血清中各种抗体都存在着半衰期，其中IgG半衰期最长为25天，其余较短一般为3～5天[8]。而那些不能作为疫苗抗原（如结构蛋白）亦可诱发免疫应答，但是由于先天屏障存在（如在细胞内），而不能与免疫细胞直接接触，诱发的抗体滴度不能维持，因此产生抗体在体内就会逐渐衰减。有些结构蛋白和部分膜蛋白，无法进入循环系统，刺激记忆淋巴细胞，所形成抗体滴度也逐渐下降。另外纯净卵壳不具有抗原作用[9]。因此本研究应用免疫后感染血清与未成熟卵混合培养，只有在虫卵中能从卵壳内分泌出的抗原，诱导的抗体滴度才会保持一定水平。利用PEG沉淀定量虫卵内抗原抗体复合物，观察各种抗原诱导抗体动态变化。
SIEA免疫后的感染血清能够抑制虫卵发育成熟，具有保护作用，这是SIEA抗卵胚胎疫苗研究的基础。我们发现免疫后感染血清与未成熟卵所形成的抗原抗体复合物被解离后仅有一条蛋白带，即54KD，而其它条带均消失，表明54KD蛋白诱导抗体能保持一定水平而不衰减。正常感染血清培养未成熟卵未出现沉淀，这与我们前述感染血清识别SIEA的结果相一致。张悟澄等发现感染日本血吸虫病肝内早期（6周）虫卵肉芽肿内并无抗体出现，7～35周肝内肉芽肿仅20%～60%可测出抗体[10] 。表明在未成熟卵阶段，感染血清很少与未成熟卵相互作用。
由于免疫后感染血清所得抗原抗体复合物中的抗原与SIEA免疫小鼠肝内虫卵所得抗原抗体复合物的54KD位置相同（待发表），并且与SIEA抗血清培养未成熟卵所得虫卵内抗原抗体复合物解离仍出现条带之一49.6KU(54KD)位置也相同[3]，因此，推测54KD蛋白在SIEA诱导保护性免疫中起着重要作用。
参考文献
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（收稿日期1998-10-15）
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