日本血吸虫中国大陆株安徽品系特异rDNA的制备及其基因克隆
中国人兽共患病杂志 1999年第2期第15卷 论 著
作者：吴海玮 陈丙莺 苏川 黄钦田 沈蕾 徐桦 陈淑贞 张兆松
单位：南京医科大学(南京，210029)
关键词： PCR；日本血吸虫；rDNA；克隆
摘 要 目的 为了制备能检测日本血吸虫种内多态性的rDNA探针，以用于不同地域日本血吸虫品系间差异的研究。方法 根据曼氏血吸虫大、小亚基的基因序列，设计引物，PCR扩增得到4.4kb的日本血吸虫中国大陆株安徽品系的rDNA片段，经纯化后克隆入pUC18质粒。结果 得到了2个转化成功的含日本血吸虫中国大陆株rDNA基因的重组质粒的JM103菌落。结论 我们采用的方法，使获取目的基因片段的手段更为简单、方便。
PREPARATION AND CLONING OF SCHISTOSOMA JAPONICUM
(CHINESE MAINLAND，ANHUI ISOLATE)RDNA
Wu Haiwei Chen Bingying Su Chuan et al
(Research Institute of Molecular and Immuno-parasitology，Nanjing Medical University，Nanjing，210029)
ABSTRACT Aim To obtain Schistosoma japonicum(Sj) rDNA probe for research on genetic diversity of the parasite.Methods We designed a pair of primers according to Schistosoma mansoni rDNA sequence and get the expected Sj specific rDNA which is about 4.4 KB long by PCR，then the amplified fragment was successfully coloned into pUC 18 plasmid vector.Results Two positive JM103 clones with the recombinant plasmid were perserved for further study.Conclusion This make it simple and convenience to get the high quality target DNA fragments.
KEY WORDS PCR Schistosoma japonicum rDNA Clone
在日本血吸虫的防治实践中，多方面的研究指出该病的诊断、治疗以及预防感染方面存在着不同地域的差异。王晓勤、毛守白等［1］报告云南、广西及安徽的日本血吸虫在小鼠体内，其形态、致病性及对吡喹酮的反应方面有不同。袁鸿昌［2］、何毅勋［3］等报告长江上游的钉螺对长江中、下游的日本血吸虫感染呈不易感性的特点。因此，中国大陆日本血吸虫品系的研究对血吸虫病的防治决策有重要的指导意义。
近十年来，随着分子生物学的发展，从基因水平上为寄生虫的种、品系分类提供了不少有力的实验手段。国内外已有人［4，5］利用曼氏血吸虫的rDNA探针分别对曼氏血吸虫和日本血吸虫进行了种内多态性分析。我们根据曼氏血吸虫rRNA的序列，用PCR方法扩增得到日本血吸虫(安徽品系)的rDNA片段并克隆入pUC18质粒，以期制备日本血吸虫的rDNA探针，从基因水平上对中国大陆境内的日本血吸虫品系进行研究。
1 材料和方法
1.1 中国大陆株日本血吸虫(安徽品系)成虫DNA的制备 将阳性钉螺(购自江苏省寄生虫病研究所)逸出尾蚴感染家兔，42天后杀兔灌洗获成虫，存液氮中备用。取液氮冻存的虫体适量，在不锈钢研钵中磨成粉，蛋白酶K消化，苯酚／氯仿抽提得到成虫基因组DNA。
1.2 PCR扩增中国大陆株日本血吸虫(安徽品系)rDNA。
1.2.1 引物设计 根据曼氏血吸虫rRNA序列［6，7］，在大、小亚基保守区域选择引物，并于引物的5＇端加上BamHI酶识别序列及两个保护碱基。利用PCRDESNA程序分析上、下游引物的G、C含量，有无互补碱基及发夹结构等参数，筛选出一对合适的引物。
1.2.2 PCR扩增 以中国大陆株日本血吸虫(安徽品系)成虫DNA为模板，用上海植物生理研究所依照我们的设计合成的引物，加入PCR试剂进行扩增，反应条件为94.0℃预变性1min，94.0℃变性15s，62.0℃复性及延伸7min，共进行30个循环，末次延伸10min。0.7％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。
1.2.3 PCR产物的纯化 琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，以消毒的锋利刀片切下扩增的目的条带。用DNA纯化试剂盒(GENECLEAN Ⅱ KIT，美国BIO101，INC.产品)提取纯化DNA。
1.3 重组及转化
1.3.1 重组DNA片段的制备 纯化的DNA片段中加入BamHI内切酶，于37℃反应3h，65℃30min灭活酶，置冰浴冷却。在上述反应体系中加入小牛肠碱性磷酸酶，使BamHI粘端去磷酸化。以苯酚／氯仿抽提，乙醇沉淀纯化经酶切的DNA片段。
1.3.2 克隆 按摩尔数5∶1取已经BamHI消化并去磷酸化的pUC18质粒和制备纯化的rDNA段，在T4DNA连接酶作用下，12℃反应过夜，获得重组子。
1.3.3 重组子的转化 以0.1M CaCl2处理生长至对数期的大肠杆菌JM103，制备感受态细胞，加入含重组子的连接反应液，42℃热休克使重组子转化入JM103，转化液铺于事先涂布了X-gal(20mg／ml)和IPTG(200mg／ml)的琼脂板上，37℃培养过夜。挑取白色菌落接种于2mlYT培养基，37℃240r/min振摇培养过夜。
1.3.4 重组子的鉴定
碱裂解法小量快速抽提质粒DNA，电泳初步鉴定为阳性的重组体质粒，再中等量扩增，碱裂解法提取、纯化重组质粒DNA，以BamHI消化，电泳鉴定酶切结果。
2 结 果
2.1 中国大陆株日本血吸虫(安徽品系)成虫DNA
经GENEQUANT仪测得DNA的OD260／280＝1.90，总量170μg，溶于三蒸水中，小量分装，存－20℃备用。
2.2 自行设计的PCR引物序列 设计的上下游引物在5＇端均加GGATCC的BamHI酶识别位点，并在其5＇端加两个碱基，使BamHI酶切易于进行，所得引物序列为：
上游引物：5＇ CTGGATCCGGGCATTTGTATGGCG 3＇
下游引物：5＇ GCGGATCCTTGTTCAATTGCCAGA 3＇
2.3 PCR扩增日本血吸虫(安徽品系)rDNA 以自行设计的引物扩增的PCR产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳分离，显示一条4.4kb的特异DNA带，但条带弱(图1)。
图1 成虫DNA及PCR产物
Fig1.PCR products and DNA of adult worm
1.PCR products (50μl)
2.PCR products (10μl)
3.Lambda DNA／EcoRI＋Hind Ⅲ marker
4.Adult worm genome DNA
2.4 克隆
将制备好的PCR片段克隆入pUC18质粒载体，转化入大肠杆菌JM103，得19个阳性菌落。分别小量培养快速抽提质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳分析质粒DNA的大小，见有2个菌落的质粒明显落后于对照质粒DNA。该两个菌落的质粒DNA经BamHI消化后电泳分析，可见除了2.7kb的质粒条带外，有4.4kb的插入DNA带，与原片段大小一致，说明重组成功(图2)。
图2 阳性菌落的BamHI消化产物
Fig2.BamHI digested products of prepared positive clones
1.Undigested recombinant pUC18 plasmid DNA
2.BamHI digested products of a prepared positive clone
3.Lambda DNA／Hind Ⅲ marker
3 讨 论
PCR是获得所需目的基因的快速有效方法。曼氏血吸虫4.4kb rDNA探针检测出曼氏血吸虫种内多态性，鉴于日本血吸虫与曼氏血吸虫均为寄生人体的血吸虫，根据曼氏血吸虫的基因序列设计引物，日本血吸虫DNA为模板，得到了预期的4.4kb日本血吸虫rDNA片段，但扩增产物得量不大，分析是引物与模板不完全匹配造成的。本研究除了在引物5＇端加了BamHI酶识别序列，还加上保护碱基［8］，使得酶切与克隆更方便，不需对PCR产物进行补齐、加接头等多步骤操作，只要纯化酶切产物即能顺利克隆入选择的质粒载体。
本研究将PCR产物成功地克隆入pUC18质粒并转化得到阳性菌落，进而可用氯化铯—溴化乙锭梯度离心制备纯化质粒再酶切，可得到大量纯DNA片段，用于标记作为探针。这种方法使制备所需DNA片段更简单、方便，片段的一致性好且易于保存。另外，组入pUC18的片段可直接用于核苷酸序列测定，以分析日本血吸虫与曼氏血吸虫该区域的差异。
目前，此rDNA片段的测序，及用此rDNA片段作为探针研究不同地域日本血吸虫品系间差异的工作正在进行，期望能对中国大陆不同地域日本血吸虫存在不同品系提供理论依据。
本研究系国家自然科学基金资助项目(No.39370634)
4 参考文献
1.Wang XQ，et al.Comparison of morphology，pathogenicity and drug response among three isolates of Schistosoma japonicum in the mainland of China.Ann Parasitol Hum Comp，1989，64∶110.
2.袁鸿昌.关于中国大陆不同地区的钉螺及日本血吸虫品系的研究.1958年全国寄生虫病学术会议资料选集.人民卫生出版社，北京：1958，186.
3.何毅勋.中国大陆日本血吸虫品系的研究I：幼虫-钉螺的相容性.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1990，8∶92.
4.Simpson AJG，et al.The arrangement of ribosomal RNA genes in Schistosoma mansoni∶Identification of polymorphic structural variants.Eur J Biochem，1984，139∶41.
5.谢觅，等.中国大陆五地日本血吸虫的DNA杂交.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1993，11∶6.
6.Ali PO，et al.Sequence of a small subunit rRNA gene of Schistosoma mansoni and its use in phylogenetic analysis.Mol Biochem Parasitol，1991，46∶201.
7.Keulen H，et al.Characterization of a 54-nucleotide gap region in the 28s rRNA gene of Schistosoma mansoni.Mol Biochem Parasitol，1991，45∶205.
8.Hung L，et al.Cleavage close to the end of DNA fragment.Promega Notes，1991，33∶12.
1997年4月10日收稿
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