五种日本血吸虫疫苗佐剂的比较研究
中国人兽共患病杂志 1999年第2期第15卷 论 著
作者：周建宁 程翔 邓荷萍
单位：同济医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室(武汉，430030)
关键词： 佐剂；日本血吸虫疫苗；参环毛蚓
指导者：姜昌富 甘燕
摘 要 因血吸虫重组疫苗是一种弱免疫原，佐剂在提呈这种弱免疫原上起着十分重要的作用。本实验结果显示日本血吸虫成虫粗抗原与佐剂FCA、Fe(OH)＋3、Fe(OH)－3、鱼油及参环毛蚓分别免疫小鼠，所得减虫率分别为33.39％、41.89％、35.43％、40.3％、48.75％。其中，Fe(OH)－3与FCA、Fe(OH)＋3与鱼油之间无显著性差异(P＞0.05)，但后两者效果显著优于前两者(P＜0.01)，参环毛蚓的效果又显著优于Fe(OH)＋3和鱼油(P＜0.01)。
COMPARISON OF THE IMMUNE EFFECTS OF
FIVE ADJUVANTS OF SCHISTOSOMA JAPONICUM VCCINE
Zhou Jianning，et al
(Tongji Medical University，Wuhan，430030)
ABSTRACT Adjuvant is important in passing the Schis to soma japonicum S.japonicum reformed vaccine because the vaccine is a inferior antigen.The results of the examination indicate∶after the rats were immuned by S.japonicum antigen(S j-Ag)with FCA，Fe(OH)+3 colloid，Fe(OH)＋3 colloid，fish oil and Pheretima aspergillum (Pa)，the reductions percentage of worm burden were 33.29％，41.89％，35.43％，40.3％，48.75％.respectively No significant difference(P＞0.05) between the groups immuned by S j-Ag with FCA and Fe(OH)3 colloid,the same to the groups immuned by Sj-Ag with Fe(OH)+3，colloid and fish oil.The effect of the latter two groups is better than the former two with significant difference(P＜0.01).The effect of Pa is better than the latter two groups with significant difference(P＜0.01).
KEY WORDS Adjuvant Schistosoma japonicum vaccine Pheretima aspergillum
血吸虫疫苗是防治血吸虫感染的有效途径，其中以用DNA重组技术合成肽或抗独特型抗体较为理想，且成本也较低。但重组抗原和合成肽这种亚单位疫苗往往是弱免疫原，因此如何应用合理的途径提呈亚单位疫苗颇为重要［1］。亦即佐剂在血吸虫的抗感染免疫中起着十分关键的作用。本实验以小鼠为对象，对包括福氏完全佐剂(FCA)及国内外未见报道的参环毛蚓(Pheretima aspergillum，Pa)、氢氧化铁正负溶胶［Fe(OH)＋3、Fe(OH)－3］和鱼油在内的佐剂进行了初步筛选及比较，现将结果予以报道。
1 材料与方法
1.1 实验动物 由同济医科大学实验动物中心提供的中国昆明株10周龄小鼠，体重20±2g。
1.2 抗原 该实验以日本血吸虫成虫粗抗原(Schistosoma japonicum Antigen，Sj-Ag)为免疫抗原，由同济医科大学寄生虫教研室提供。使用前测定其蛋白含量。
1.3 佐剂
1.3.1 FCA 由同济医科大学免疫教研室提供。
1.3.2 Pa 由同济医科大学寄生虫教研室提供。使用前测其蛋白含量。
1.3.3 Fe(OH)＋3、Fe(OH)－3、鱼油 由同济医科大学化学教研室提供。
1.4 尾蚴 湖南血吸虫防治研究所提供阳性钉螺，按常规法逸出尾蚴［2］。
1.5 免疫 将70只小鼠随机分为7组(A、B、C、D、E、F、G)，每组10只。以A组为空白对照组，其余6组均于背部皮下注入免疫原。其中Sj-Ag剂量为100μg／只，佐剂体积与Sj-Ag相等，混匀。
1.5.1 第一次免疫 B组注入Sj-Ag，C组注入Sj-Ag与FCA，D组注入Sj-Ag与Fe(OH)＋3，E组注入Sj-Ag与Fe(OH)－3，F组注入Sj-Ag与鱼油，G组注入Sj-Ag与Pa。
1.5.2 第二次免疫 第一次免疫后1周，B～G组均注入Sj-Ag。
1.5.3 第三次免疫 第二次免疫后1周，B～G组均注入Sj-Ag。
1.6 攻击 于第三次免疫后第14天在每张大小为1cm2的盖玻片上收集常规法逸出的尾蚴60±4条，置于小鼠裸露的腹部皮肤15min，攻击后第25天断颈处死小鼠，经门脉灌注法检获成虫、计数并计算减虫率［实验组虫荷均数／对照组虫荷均数)×100％］。
1.7 数据处理 本实验所有数据经SAS软件包作。
2 实验结果
各组小鼠经门脉灌注检获的血吸虫数经T检验，其结果与对照组比较均有显著性差异(P＜0.01)，除C、E组与B组无显著性差异外(P＞0.05)，其余各组均与B组有显著性差异(P＜0.01)。各佐剂组互相比较可知C组与D、F、G组均有显著性差异(P＜0.01)，而G组与C、D、E、F各组 有显著性差异(P＜0.01)。此外，B～G组减虫率分别为30.99％、33.39％、41.89％、35.43％、40.3％和48.75％，详见表1。
表1 不同佐剂免疫小鼠各组剖检结果
| 分组 |
免疫原 |
动
物
数
(只) |
虫荷
均数
(X±S) |
P1 |
P2 |
减虫率
(%) |
| A |
|
9 |
24.78±2.49 |
|
|
|
| B |
Sj-Ag |
10 |
17.1±3.51 |
＜0.01 |
|
30.99 |
| C* |
Sj-Ag＋FCA |
8 |
16.5±4.58 |
＜0.01 |
＞0.05 |
33.39 |
| D** |
Sj-Ag＋Fe(OH)＋3 |
10 |
14.4±1.35 |
＜0.01 |
＜0.01 |
41.89 |
| E* |
Sj-Ag＋Fe(OH)－3 |
9 |
16.0±2.45 |
＜0.01 |
＞0.05 |
35.43 |
| F** |
Sj-Ag＋鱼油 |
10 |
14.8±2.97 |
＜0.01 |
＜0.01 |
40.3 |
| G*** |
Sj-Ag＋Pa |
10 |
12.7±1.42 |
＜0.01 |
＜0.01 |
48.75 |
P1为B～G组与A组检虫均数比较T检验结果。
P2为C～G组与B组检虫均数比较T检验结果。
*及**组内均无显著性差异(P＞0.05)，*组与**组间比较均有显著性差异(P＜0.01)，*组与*及**组间比较均有显著性差异(P＜0.01)。
3 讨 论
近年关于血吸虫疫苗的研究多集中在重组抗原和合成肽方面，但因其是弱免疫原，佐剂在诱导保护力的产生上便起着重要的作用。但已研究过的佐剂或无毒但无效，或有效但有毒，都不尽人意［1］。本实验对国内外尚未见报道的Fe(OH)＋3、Fe(OH)－3、鱼油及Pa进行了初步筛选和比较。从各组与对照组比较均有显著性差异(P＜0.01)来看，它们均有一定效果。
FCA是一种常用的佐剂，但因其只能诱导体液免疫，而不能诱导细胞免疫［1］。本实验结果亦证明其效果不佳，减虫率仅33.39％，与有报道的30%～40％［3］相近，且与单用Sj-Ag并无显著性差异(P＞0.05)。
Fe(OH)＋3因推测其与氢氧化铝凝胶(AHG)有相似的分子结构，从而也可提呈免疫原，实验结果显示其减虫率为41.89％，与单用Sj-Ag也有显著性差异(P＜0.01)。而AHG(抗原为Sm成虫155kDa蛋白)的减虫率仅能达到25％［3］，Fe(OH)＋3显著高于AHG，但因本实验所用免疫原为日本血吸虫成虫粗抗原，效果应强于AHG所用的纯蛋白质抗原，故其效果是否确实强于AHG还有待于进一步研究。至于Fe(OH)－3结构虽应类似于Fe(OH)＋3，但减虫率仅35.43％，且与单用Sj-Ag无显著性差异(P＞0.05)，故其效果不如Fe(OH)＋3。
鱼油是一种生物可降解的磷脂类小泡(脂质体)，有报道提示它可以提呈抗原，并强烈刺激细胞免疫和体液免疫，且完全无毒［1］。结果提示其与单用Sj-Ag有显著性差异(P＜0.01)，减虫率40.30％，有较明显的效果。
1995年，Wisnewski等人曾报道陆生蚯蚓与曼氏血吸虫的抗原有交叉反应，单用其免疫小鼠获得了36％的减虫率［4］。本实验以其为佐剂，收到了较好的效果，减虫率达48.75％，比单用Sj-Ag提高近50％，T检验亦有显著性差异(P＜0.01)。
在这5种佐剂中，除Fe(OH)－3与FCA无显著性差异(P＜0.05)外，Fe(OH)＋3、鱼油和Pa均与FCA有显著性差异(P＞0.01)，说明除Fe(OH)－3外，其余均显著优于FCA。在Fe(OH)＋3、鱼油和Pa中，Pa又与Fe(OH)＋3和鱼油有显著性差异(P＜0.01)。从减虫率上看也显著高于这两种佐剂。说明Pa在这5种佐剂中具最佳效果，可能因为Pa兼具佐剂和免疫原的作用，并可同时刺激细胞免疫和体液免疫［5，6］，使其效果较一般佐剂大增强。其具体机制还有待进一步研究。
关于实验方法及条件，本实验的抗原与佐剂之比为1∶1，是否存在更优越的配比还有待深入研究。此外，佐剂的制备，免疫途径，间隔时间等实验条件均有待于进一步探讨，以期寻找出一条最佳免疫途径。同时，有报道显示脂质体吸附于AHG可进一步增强免疫应答［1］，这也是一个相当有前途的研究方向。
综上所述，本实验对FCA、Fe(OH)＋3、Fe(OH)－3、鱼油及Pa这5种佐剂进行了初步筛选和比较，发现Fe(OH)＋3、鱼油效果优于FCA和Fe(OH)－3，而Pa效果又优于Fe(OH)＋3和鱼油，能显著提高Sj-Ag的抗血吸虫感染保护能力。此外，蚯蚓成本低廉，养殖简易，佐剂的制备亦不繁杂，推广应用有相当大的发展潜力和不容忽视的前景。
4 参考文献
1.Smith NC.Concepts and strategies for anti-parasite immunoprophylaxis and therapy.Int J Parasitol，1992，22(8)∶1047.
2.Shi YE，et al.Schistosoma japonicum:An ultra-violet-attenuated corcanrial vaccine applicable in the Field for water buffaloes.Exp Parasitology，1990，71∶100.
3.赵慰先，等主编.人体寄生虫学.第2版.北京：人民卫生出版社，1994∶365～368.
4.Wisnewski AV，et al.Induction of protective immunity to schistosoiasis with immunologiccally cress-veactive inmbri-cus molecules.International Journel for Parasitology，1995，25(4)∶503.
5.田琼，等.中药地龙胶囊(912)对小鼠移植瘤抑制作用机理的研究.中国肿瘤临床，1991，18(3)∶156.
6.张绍章，等.蚯蚓提取物对小鼠脾脏抗体形成细胞的影响。第四军医大学学报，1993，14(5)∶350.
1997年11月30日收稿
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